成都华西华科研究所分析蛋白质组学技术用于骨质疏松症研究与QCT骨密度软件体模检测

蛋白质组学技术用于骨质疏松症的研究 

随着大《生物体全基因组序列的获得、特别是人类 基因组序列单图的完成，基因组学的研究重点不可避免 地从结构基因组学转向功能基因组学，而蛋白质组学正 是作为功能基因组研究的重要支柱在上世纪90年代中 期应运而生。由于蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代 谢和调控途径的主要执行者，因此蛋白质不仅是多种致 病因子对机体作用最重要的粑分子，而且也成为大多数 药物的药靶乃至直接的药物。骨质疏松症是指正常骨矿 化的骨里减少伴骨腌性增加的一种骨病变。近几年的研 究发现其机制主要涉及细胞因子、生长因子和内分泌/旁 分泌激素间的耦联（如OPG/RANK/KANKL系统），使我 们对其发病机理的认识深入到分子水平，但骨质疏松症 领域仍有许多问題不淸楚，将蛋白质组学技术用于骨质 疏松症的研究，将有助于阐明骨质疏松症的发生、发展机 制、鉴定新的药靶，以及新的生物标志物，并用于指导临 床试验。现将蛋白质组学的主要进展和在骨质疏松症中 的应用介绍如下。

(一）蛋白质组技术的研究进展

蛋白质组是指由一个基因组、一种生物或一种细胞/

组织表达的所有蛋白质⑴。蛋白质组研究的技术路线主 要是高通童双向电泳进行蛋白质的分离，再用专业计算 机软件进行图象分析，然后通过质谱技术及蛋白质数据 库信息对凝胶上的蛋白质进行分析和鉴定。双向凝胶电 泳、质谱和计算机图象数据处理是蛋白质组研究的三大 支撑技术。

1.  蛋白质组的主要分离技术——双向凝胶电泳 双向凝胶电泳（two - dimensional gel e丨ectrophoresis，2 ~ DFJ的基本原理娃蛋白质首先根据其等电点在pH梯度 胶中等电聚焦，然后按照分子簠的大小进行SDS-PAGE 的第二次电泳分离。2-DE由O’Farrell首次建立并成 功分离出约1000个E.coli蛋白，随苷技术的飞速发展， 现在在一张凝胶上可分离到10000多个蛋白。2-DE可 最大程度的分离蛋白，分离的蛋白点可全面分析，因而2 -DE成为蛋白质组研究的核心。

当前最常用的2-DE分离方法为1PG-DALT,由 于固相pH梯度（immobilized pH gradient,丨PG)出现解决 了 pH梯度不稳的问题，从而使2-DE达到了高度的重 复性。蛋白质组分析要求细胞或组织内所有的蛋白质都 溶丁样品缓冲液，并在2-DE中得到分离。蛋白样品制 备的好坏直接影响到：①蛋甴质组信息的完整性；②双 向电泳图谱的分辨率和图谱质镊。对疏水性强的蛋白、 难溶性蛋白、大分子童蛋白、强酸和强碱性蛋白的瑢解 提取需要特别的注意，这些蛋白的2-DE分离受到限 制。提取后蛋白定贵直接影响到双向电泳的重复性和差 异蛋白的筛选。长度为24cm. pH梯度为3〜12的IPG 胶条可最大程度的对样品进行粗分离利用不同pH 梯度相互重叠的丨PG胶条进行电泳，可得到比宽pH梯 度胶条更多的蛋白点，质因是宽pH梯度凝胶上的一个 蛋白点可能是两个或多个蛋白单黉在一起，使用窄pH 梯度凝胶可提高分辨率。由于碱性范围内凝胶基质的不 稳定及逆向电内渗的产生，对等电点超过10的碱性蛋 白，通过产生0〜10%的山梨醉梯度和16%的异丙醉可 喊少之，也可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性^[«。

2.  蛋白质组的主要鉴定技术一质讲基质辅助 激光解吸（ matrix - assisted laser desorption/ionization, MALDI)是利用一定波长的激光束辐射离子源内样品， 使其发生解吸电离。MALDI可分析分子最大或疏水性 强的蛋白质，可分析较复杂的肽混合物或物理性质相差 极大的蛋白混合物，切不受样品中所含添加物、缓冲液或 盐的影响，因而可高通该分析2-DE上的蛋白；肽质指 纹术（peptide mass fingerprint，PiMF)是由 Henze丨等提出， 用酶裂解2-DE或PVDF膜上的蛋白，裂解片段的分子 缓由质谱来测定，这一技术完成的肽瓰最可梢确到0. 1 个分子里单位，由于MALD丨-TOF使多肽只产生一个电 荷，通常用MALDI - TOF来得到一个蛋白肽质指纹； MALDI的静电反射器和延迟提取装置可以提高仪器的 分辨率，获得多肽的精确分子里W;MALD丨的源后哀变 装置（post-source decay, PSD)能产生多肽的序列信息， 苻先进行肽质指纹鉴定，然后一个有意义的多肽在质进

仪中被选作为“母离子”.在飞行至离子反应器的过程中 降解为子离子，在反应器中用逐渐降低的电压可测最至 检测器的不同大小的片段^f5l_;

电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spec­trometry, ESIMS) 是一 连续离子化的方法，从液相中产生 离子，被质谱所检测，可以得到肽段的分子M。用于蛋白 质组研究的ESIMS常用型号为三联四极质讲仪，由电雾 源产生的肽离子在第一个四极质谱中测录，有意义的片 段被送至第二个四极质谱中，悄性气体轰击使其成为碎 片，所得产物在第三个四极质谱中测笸^[6];串联质进 (Tandem-MS),即在第一级质谱得到肽的分子离子，分 子离子被悄性气体碰撺诱导分裂（collision - induced dis­sociation, CID) 产生碎片离子，由下 一级质谱得到 目标肽 序列信息，串联质进得到的N-和C*•末端质童及中间 几个少数残基的序列等被称为“肽序列标签（peptide se­quence tag, PST), 肽序列标签比部分肽序列信息在査库 时更具有限制性~;因为ESI是液体进样，MALDI是固 体进样，所以ESI句以与现有的蛋白分析方法如高效液 相层析（high performance liquid chromatography, HIJPC)、 毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE)相匹配，将反相 液相色谱和串联质进联用，可在数十个picomde的水平 检测，若利用毛细管色谱与串联质谱联用，可在低pico- mole到高femtomo丨e水平检测，利用毛细管电泳与串联 质谱联用，可在小于femtomole水平检测，甚至在atto- mole水平进行¹~ ;纳米电喷雾申联质谱（nano - electros­pray ionization tandem mass spectrometry) 能在 较低的 fem- tomole水平上测得肽段序列

3.  蛋白质组的数据分析工具一蛋白质组倌息学

(1) 2-DF.的图像分析2-DE n了分离到数千个蛋 白斑点，甚至可到1万个，必须利用图象分析软件才能正 确分析，分析过程包括：图形处理、斑点检査与量化、背景 过滤、2-DE匹配与比较、构造合成凝胶以及统计分析 等。蛋白表达谱进行定馕比较时，必须慎重下结论，大约 总有10%的点由于胶的质量原因未被检测到，手工调整 (点检测和匹配）仍非常耗时间费精力，还会导致错配发 生。图像处理的算法尽管已经很先进，但样品制备、电泳 和染色的可重复性也会影响图像分析结果。虽然软件可 以通过数学手段补偿，但是单靠软件无法完全解决问题， 必须进一步提高上游工作的自动化来重复性

蛋白质研究的一个蚩要内容是蛋白质翻译后修饰的 研究，运用图象分析软件，在双向电泳的参考图上，蛋白 质位置与该蛋白的理论预测位S不同，在这两个位置之 间连一直线，即为该蛋白的矢M,这样的图谱称为双向电 泳矢M图。在矢里图上有的蛋白具有一个矢量，有的具 有两个或多个矢《，表明可能存在多种翻译后的修

(2>蛋白质鉴定的数据库搜索蛋白质数据库（_pro- teome database)被认为是蛋白庾组知识的储存库，包含所 有鉴定的蛋白质信息：蛋白质序列、核甘酸序列、2-DE、 三维结构、从序列模违结构、翮译后修饰、基因组、代谢库

及蛋白质相互作用等。

蛋白质数据库将蛋白质的序列转变为相应厲性参 数，形成厲性化的数据库，又称虚拟数据库。属性参数可 分为两级，一级厲性指完整蛋白的属性，像蛋白质质撥、 等电点、蛋白质N-端与C-端序列标记、蛋白质氨基酸 组分等，二级厲性指蛋白质片段的属性如肽质指纹 (PMF)、肽序列标签（PST)等。通常组合未知蛋白的各 种属性参数来搜索数据库，搜索的结果是按照数据库中 肽段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，冠军肽 片段可能代表未知蛋白，若冠亚军的肽片段存在较大差 异，且这个蛋白与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正 确鉴定的可能性较大^|12]。

(二）蛋白质组学的新动向——定量和自动化

1.定M蛋白质组学尽赀可以通过标准化和自动 化增加2-DE结果的柬复性，但图像的对比仍冇很多人 为因素，因为由操作者来选取蛋白点的边界，同时蛋白质 往往会发生迁移，很难进行蛋白点的正确匹配。

Oda等用稳定同位索标记蛋白质的方法来定撤分 析蛋白质，一组酵母生长在含有天然氮（^MN 99.6%

4.  4%)的培养基中，另一组醉母生长在含冇^mN(>%%) 的相同培养基中，经过一段时间的培养后，细胞混合提取 蛋白，先用反相高效液相层析，再用SDS-PAGE凝胶分 离，切割目标蛋白胶内消化后质谱鉴定，由于同位素标记 蛋白的理化性质不变，目标蛋白在质谱图上表现为相隔 1个质贵中位的双峰，比较双峰强度躭可稍确定S同一 蛋白在不同生长条件下的差异。

最近Gygi^:M]使用了一种同位索亲和标签（isotope^ coded affinity tags,丨CAT>,并提出了定童蛋白放组的新战 略。丨CAT试剂的结构包括三部分：亲和反应基团（生物 素标记），用来分离1CAT标记的多肽；连接子用N位索 分子标记；专一的化学反应基团，能与蛋白质的Cys上的 SH专一反应。

ICAT的连接子由8个氡（H>原子或8个氘（丨))原子 分别标记，由不同顷子标id的丨CAT分子质墩正好相差 8/xa。在不同生长条件下的细胞被裂解后，分别加人不同 标记的丨CAT与蛋白质反应，ICAT会专一的与蛋内质中 Cys共价结合，待充分反应后，将二者等埔混合，酶解后 亲和层析，含丨CAT的酶解片段可以进行HPLC- MS/ MS分析对ICAT标记的相同肽段总是一前一后相 邻分布在MS阁谐t,分子世正好相差8Da,计算二者峰 m,就可以知道不同细胞状态下的蛋白质的表达差异。

二色炎光标记 DIGE(differentia丨 gel electrophoresis) 技术是另一定M蛋白质组学技术，其原理为Cy3和 Cy5分别标id A和B两个不同样品，Cy2标记A和B的 各-半样品，然后混合在间一等电聚焦胶条和聚内烯酰 胺凝胶上电泳.用三种波长的激光激发扫描得到凝胶图 像。将三色荧光标记蛋白质组学技术与硝酸银和考马斯 亮蓝染色的技术相比较发现：Cy标记的双向电泳凝胶灵 敏度高，4检测到低丰度蛋白质，在疾病的发病机制和新 药药理毒理中，起作用的蛋白质往往是低丰度蛋A质。

三色荧光标记蛋白质在同一块胶上进行电泳，实验具冇 较好的重复性。当进行多样本检测时，以Cy2来标记所 有样品中的蛋白质为内标，每块凝胶中Cy2标记样品均 为所测样品的等贵混合物，如两个样品则均为1/2的混 合，三个样品则为1/3的混合，依次类推，理论上在一块 凝胶上所有样品蛋白均有Cy2来标记，胶内对Cy2标记 点进行匹配，匹配率可达100%，将结果以Cy2为内标计 算比值，即Cy3/ Cy2与Cy5/ Cy2的比值，然后作统计分 析.这样避免了胶与胶之间的误差，可反映蛋白质的真实 改变程度，降低了假阳性或假阴性，硝酸银和考马斯亮 蓝染色凝胶中没有内标，无法避免胶与胶之间的误差。 三色焚光凝胶扫描后，用Decyder Differentia丨in - gel Analysis Version 4.00.06 和 Biological Variation Analysis 图像分析软件可进行三维图像分析，仪器和软件自动进 行图形处理、斑点检査与《化、背景过滤、2-DF.匹配与 比较、构造合成凝胶以及统计分析等。中间没有人为因 素的干扰并且实现高通M和实验的准确性。

2.蛋白组学的自动化目前蛋白质组研究的思路 是2-DE分离样品，经图像分析后，选取2-DE胶上的 蛋白点切割后酶解，然后进行质谱鉴定。等发展 f —套称为分子扫描（molecular scanner)的方法，它是将 粮个2-DE胶上的蛋白质样品同时觴解，并将酶解的片 段同时转移到另一张腴上，其操作是在2-DE胶和转移 膜之间加人一个经固定化的蛋白水解酶的膜，形成类似 三明治的结构，蛋白水解和转移同时进行。然后用 MALDI - TOF对膜上的全体样品进行整体扫描测定，为 实现蛋白质组研究的规模化、自动化以及临床应用提供 了一个崭新的思路和方法。

基于抗原与抗体或受体与配基等的生物分子相互作 用分析（Biomo丨ecular interaction analysis, BIA)，一方作为 诱饵分子固定在芯片上，与液体中分子发生反应，而高通 里的筛选先导化合物或抗体等，这种芯片叫生物传感器 (bisensor chip), BIA 与 MALD1 - TOF 或纳米电喷雾电 离串联质进联合的系统可以实现在线自动分析。这个系 统通过一个类似三明治结构的微里液体流动装罝（mj- crofluidics)而实现的：3/zL麻解液在毛细管中被两个气七 包围，当第一个气泡到达芯片上的蛋白点时，液体停止流 动，蛋白被消化完毕后，液体重新流动，被鵑解的蛋白被 在线的质谱所检测^117]。

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