成都华西华科研究所分析转基因动物用于骨质疏松症模型与QCT骨密度软件体模检测

转基因动物用于骨质 疏松症模型（Transgenic animals applied in osteoporosis model)

转基因鼠提供了一种极好的实验装置，它可以用来研究离体实验系统.即在体外或细胞条件下，所不能模拟或完全评价的复杂调节系统。该棋型特别适用于分析能合成胞外基质的细胞，这是因为该类细胞对外界环境调节信号的响应依赖于细胞分化的状态。由于离体系统并不能有效地模拟这种差异，所以发展完整动物a能解决关注的分子问題的分析系统成为迫切葙要。这一节的目的在于举一个例子，用来回答一些细微的关于蛋白结构和影响背结构或骨细胞分化的基W阑控 的问既.而这些还没有在其他实验系统下得到解决。另 外，新发展的还没有用于骨且在该领域具有研究潜力的 转基因方法也将在下面进行探讨。

一、骨中结构大分子分析（Analysis of struc- tural macromolecules in bone)

I型胶厣蛋白是骨中的主要结构蛋白，而丨I型是软 背中基本的胶原蛋白，影响这两类分子结构完整性的突 变，能相应地导致骨生成不全。这两类遗传疾病具有显 性失活特点，表明是由于突变基因产物的存在导致该病 的发生。当对患有该种疾病的人迸行分子遗传研究后表 明疾病进的严重性与特定苺因的突变有关，而通过转 基因鼠，我们能淸楚地理解这些突变是如何影响蛋白的 功能。在携有能产生胶原蛋白基因的〇丨的转基因鼠中， 不断有突变胶原蛋白基因的显性失活特性的报道％。这 些小鼠显示出周期致死O丨。分子分析表明致死性与转 基因的表达水平有关，转移基因的表达量仅是内源正常 胶原蛋白基因的10%,这表明一小部分突变基因所形成 的胞外基质影响了所有骨骼的稳定性。在患有该病但仍 有活力的小鼠中，转移基因的表达水平与内源基因基本 相当，这些发现表明当突变的胶原蛋白分子被严重破坏， 如内部缺失，那么仅有极少的突变分子会在基质中积累。 突变对分子组装影响轻微，因此导致大部分的改变了的 胶原蛋白分子在胞外基质积累并产生严亩的表沏。以突 变为基础来理解疾病的严東性要求我们弁淸分子是如何 组装、分泌并掺人到胞外基质中去的。虽然这些步骤可 以在系统中得以明确M，但是研究功能意义却需要通过 转基因手段。

在D型胶原蛋白的研究中也发现了相似结果。在小 鼠中，该基因甘氨酸位点的突变引起了软骨发育不全的 表型^f<1。然而，大片段的内部缺失引起的突变具有史多 的表型，这些或许可以用作大动物中骨关节突变的实验 模正常的丨丨型胶原蛋白基因的过量表达也同样会破 坏软骨组织的形成这个审:要的发现给我们在进行任 何骨病基因治疗时提出的新的要求。既然一个基质外基 因的高组成性表达或组织错义表达N突变胶原蛋臼基因 的低*表达同样冇害，那么纠正胶原蛋白基丙就需要具 有组织特异型和正常调控的启动子。

胶原蛋白从胞外基质酶周转的第一步是哺乳动物胶 原蛋白酶在螵旋中特定位点进行切割。在切割位点具有 突变的胶原蛋白分子能较抵抗酶的降解，在携有该突变 的胶原蛋白转基因的小鼠中发现了胚胎致死型，虽然致 死不是不明异海三聚体积累的结果，但可能是alU)同源 三聚体的产生的结果。当将该突变通过同源里组的方法 放人内源基因中，一种类似于人类硬皮病的纤维咽出现 了，并增加了骨的密度¹⁶⁾,该研究与其说是一个胚胎玆微 注射的转基因方法，还不如说是一种强有力的遗传操作 方法的例子。通过操纵内源基因，突变基因的表达水平 受到紧密的控制，间时使突变在转移的苺W随机整合在

整个基因组的情况下，不易产生位置效应。虽然技术方 面仍需进一步研究，但是这些转基因动物会成为最好的 疾病实验分析模塱。

通过插人诱变使一个内脒基因失活是另外一个研究 大分子在器官和组织发育过程中重要性的工具，在来源 于含有逆转录病毐插入的亲合型双亲的纯合小鼠中， MOV-13小鼠是一例胚胎致死型，进一步的研究揭示， 逆转录病毒的插人打乱了 cola丨基因座。纯合铟小鼠1 甩胶原蛋白失活导致胚胎致死的原因是动脉在骨形成前 破？iU这些小鹹在研究胶职蛋白调控和骨生物学方面具 有众多应用。研究表明，胶原蛋白突变基因治疗可以通 过向其中导人一个正常的胶原蛋白基因迸行，转人的基 因有利于纯合型MOV- 13小鼠片发疗^m，最初，并没有 意识到杂合型MOV-13小鼠是异常的。然而，灵敏的 成像和技术测试的确表明轻微的#质疏松在杂合MOV -13中是存在的，但能在成年早期通过骨的重新模化而 得到改轉。这些小鼠是极好的人类丨型OI的鼠源模沏。

来源于纯合MOV- 13小鼠的细胞是进行体外研究 转染的胶原蛋白和内源大分子相互作用的有用工具。例 如，胶原蛋白和纤连蛋白粘连在一起的亊实是通过以下 手段证实的，即当正常的能形成纤连-胶原蛋白复合物 的胶原蛋白基因转染后能够聚集，相反如果转染的胶顷 蛋白基因在某一个对于与纤连蛋白连接重要的位点发生 突变，，那么就不会出现聚集现象^[8匕从人类方面研究， 很明显在肽段的N-末端具冇特殊的切割位点，这是因 为使切割K失活的突变产生了改变的胶原蛋白分子并导 致了 ehlers-DanbsVl型。然而，直到现在这些研究是通 过鼠内源具有诱变的形式进行的，所以该区域的真正重 要性将不能被真正低评价。

除了丨和D塑胶原蛋白在各种组织中的巨大贡献， 另外一些小胶顷蛋白和非胶原蛋白也同大的胶原蛋白相 互作用，以此来修饰相似组成组织中大分子胶原蛋白的 结构功能。这种修饰的功能可以通过转基因鼠或小胶原 蛋白的自然突变来评价。n型胶原蛋白突变能引起骨后 发育不全。IX型胶原蛋白是与II型胶原蛋白连在一起 的，并促进其与非胶原蛋白的相互作用。一个能中断X 型胶原蛋白Cdna突变的基于的表达会产生易于形成退 化件关节炎的较轻的软骨发育不全⁽⁹⁾。而该基因的无效 突变会导致更轻的性关节炎病。XI型胶原蛋白对软骨结 构及后面骨形成的1：要性已在cho/cho小鼠中得以证实， 其中cho/cho小鼠携有一个无效突变的al(XI)基因，并 能导致周期致死表型，它表现出骨的严重破坏和缩 短^[,0】。

在皮肤和肌腱中，V型和I型胶股蛋白有联系，V 甩胶原蛋白有可能调控丨型纤维的形成，且可能与R型 影响n型胶原蛋白纤维形成的方式相同。n-末端球型 缺失的a2(V)链的表达导致了像ehlers- danbrs丨型的表 型^ln]。虽然韧带松弛导致了严重的kyphoscoliosis,但骨 的形成是正常的。随著其他小分子胶原蛋白的发现，他 们在胞外基质中的结构功能可以通过像上面所说的基因

诱变的方式来研究_u虽然人类遗传连锁研究最终弄淸这 些基因的功能，但相比而言不如转基因方法快，同时还可 以通过转基W进行进一步的实验操纵。

二、骨中结构大分子的顺式调控（€^1*吨11^-

tion of structural macromoles in bone)想要确定一个启动子中能够调控胶职蛋白基于表达的 区域可以通过将启动子的某些片段同报告基因，如氣霉柰， 乙酰基转移酶(CAr)或_a-半乳糖甘酶连接在一起的方式进 行。这些研究最初是应用于瞬时转染的骨形成细胞系。然 而，当在转基因鼠中检测相似结构时，也观察到明显的差异。 可以通过分析瞬时感染的培养细胞来鉴定具有调控能力的 位点，也可以对转基因动物进行分析来评价某些位点的生物 学意义。通过分析转基因动物的启动子可以揭示对于高效 表达和组织特异性表达所必需的位点。

COL1A1启动子受到了人们更多的关注。研究表 明，导人具有大部分侧翼序列的完整基因能够在合适的 组织中产生高效表达。分析这个完整的基因表明，基因 的许多区域对于组织特异性表达非常关键。在产生I型 胶顷蛋白的细胞中，至少有2.3kb的Y转移上游序列对 于胶原蛋白的高效表达是必需的。在各种已鉴定的调控 元件中，丨铟胶原蛋白基因中的第一个内含子对调节该基 因的高效表达，在转染元件中受到广泛的关注，佴当相同 的结构转人到小鼠中，其特异性降低。这似乎说明转录 标志基因的一个属内的内含子对其高效表达是必莴的。 并且它可能是通过增加核内RNA的转录过程，而不是转 移基因的转录起作用。

进一步分解5’上游区域发现，在里面有明显的以独 立形式存在的DNA元件，这些DNA元件对于不同I甩 胶原蛋白的高效表达是非常重要的，复杂的启动子似乎 允许单个基因在不同的产生细胞丨型胶原蛋白中受到不 同的调控，如在骨，肌腱和皮肤中^h2]，目前，搞得最淸楚 的是骨中调控I型表达的调控元件。该元件大约为 49bp,存在于转录起始位点上游1.7kb处。删除基因 中的这段49bp,导致转人骨中该基因活性丧失，但却能 在肌腱中保持活性。这说明从启动子的5’端到调控元 件之间存在在皮肤和肌腱中高效表达的调控区域。在血 符平滑肌细胞中高效表达所需的关键元件并没有存在于 5’端。然而第一个内含子中冇一段序列是真皮层成纤维 细胞群恰当表达所必需的、对这些调控元件进行作 用和确定与它们相互作用的转录W子，对于我们理解发 會途径和影响不同组织细胞以不同的水平来表达相间胶 原蛋白基因的信号是关键的一步。

相似的针对COL1A2基因的元件也正在进行。 COL丨A2启动子是第一个在转基因鼠中进行研究的胶原 蛋白启动子，实验结果表明其在肌腱中特异表达。这些 研究表明调控元件对于组织特异表达很t要◊并且 COL1A2的调控区域与COL1A1的差异敁著"^sl。

现在注意力正集中在II型胶原蛋白基因t。体外转染 研究表明第一个内含子的一个区域对商效表达非常重要¹¹⁶¹,并且该结果也在后来的转基因鼠中得以证实。在 转染的软骨细胞和转基因鼠种，序列稍确细胞定位的工作 正在进行。大多数的研究将软骨细胞作为一个统一分化 的细胞群，然而，我们发现的证据表明内含子只有不同的 区域,这些不同的区域在软骨细胞分化的不同的活性。

虽然在瞬时转染研究中，背钙索蛋白启动子引起了 很大的注意.何是用转箪因鼠进行研究的仅有两项被发 表。一项表明当转移的基因是生长素时骨明显生长^U6], 然而另一项研究对体外进行的启动子作图和调节工作的 相关性提出了疑问^h71。这要求宙要对另外一些在骨中 表达基因的启动子进行进一步研究。为什么利用转染的 细胞和利用从转基因鼠中分离的相似细胞所进行的启动 子分析结果会有差别？结果的差异可能与菌系介导的转 移途径有关，这可能是一个有利的解释。在该途径中，整 合的DNA有机会与核基质支架蛋白相互作用，同时转移 的基因有甲基化修饰。第二个原因是在转基因鼠中表达 这些基因的细胞已经达到了完全分化，而坍养的骨形成 细胞的分化状态不稳定且也不容易确定。一个修饰的基 因在转基因动物的颅盖骨中具有活性，然而当该骨细胞 在体外进行培养时该基因失去活性^ha)。该现象说明了 在骨中表达COL1A1基因时细胞分化状态的重要性。相 反上述全长的基因在培养细胞中仍然A有活性。该结 采表明修剪f的基因在脱分化的骨细胞中已经失去了维 持其活性的元件，但却保留了仅能够在全分化的骨细胞 中具有活性的元件。随之表明当这些培养细胞在体外形 成付结后，上述修剪的基因被歌新激活。由此町知，对细 胞分化状态敏感的反应元件结构可用来检测种细胞群中 个体细胞分化状态的标志。转基因可以作为改变骨细胞 特定基因表达的工具抑制表达。

转基因技术的一个重要应用就是建立抑制靶基因表 达系统。其中一个成功的方法就是通过转基因产生的反 义RNA来特异地抑制目的基因的表达。反义RNA的合 成受到耦联在转基因上启动子序列的调控。反义RNA 和正义RNA的相互作用降低r正义RNA产生功能蛋白 的能力。该方法用于骨中鏟成功的例子是在携有内部缺 失小基因的小类proal( I )链的转基因小鼠中减轻脆骨 致死。在该系统中小类小基因产生缩短的_pr〇al( I ) 链，该链能与小鼠中正常的proal( I )链相互作用并导 致正常的proal( I〉链的降解，由于不能产生足够的功 能胶原蛋白而导致脆骨。通过向其中引人第二个箪因， 该基因携带与内源缺失小基因相似的反义基因，从而导 致致死表犁降低。反义RNA的存在阻止了缩短的proal (I )链的合成，并导致正常小鼠proalU )链的积累。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
网址:http:// www.qctqct.cn  
手机 : 13072875151传真 :028-65830598
市场部电话 :028-65830598 028-67708638  83190122
在线 QQ:110480527 联系人 : 王先生
邮箱:samwangcn@126.com
地址 : 成都市静康路536号