成都华西华科研究所研发生产定量CT QCT骨密度体模软件分析系统软骨细胞调亡基质矿化与QCT骨密度体模软件检测骨密度方法

(一）软骨细胞凋亡的概念及作用 软骨细胞调亡（apoptosis)是软脅细胞程序化死亡 (programmed cell death, PCI))的一种形式，是一个主动 的、信号依赖件的细胞死亡过程，既可在生理条件下发 生，也可在病理条件下发生，用以淸除体内不浠要的细胞 或对自身夯害的细胞，以维持正常生理过程的进行。软 骨细胞肥大、成熟后，最终是通过凋亡来实现已终末分化 的软#细胞的死亡和淸除,，并且矿化进程与凋亡是相互 促进的.凋亡发生在软骨组织被骨组织取代之前，软骨的 凋亡小体最终参与基质钙化。凋亡小体内碱件磷酸酶 (AKP)活性极离，内含活化的三磷酸核苷酸焦磷酸水解 酶（NTPPH)，它具有结合钙离子、水解三磷酸核苷酸、加 速钙磷沉淀的作用。软骨细胞凋亡对软骨基质矿化的作 用主要有：①细胞凋亡后被动腾出空间以利干血管和骨 细胞的侵人；②促进钙的积累和基质钙化；③生长因子的 释放与激活；④维护生长板内环境的稳定^[sl。

(二〉软骨细胞凋亡的机制 软#细胞凋亡可被分为起动和完成两个阶段（图 5-4)。凡是能影响线粒体功能、细胞死亡受体活性或是 能引起内所网（endoplasmic reticu丨um, ER)应激（stress)的 W素均能启动软钟细胞的凋亡过程。细胞的凋亡过程始 于Caspases启动因子的活化，而以细胞结构瓦解，细胞质 与细胞核被包裹形成凋亡小体而告终¹⁵¹。

细飽死亡诱导因索

I

起始阶段

线粒体      死亡受体 ER应激

Ca* pa«e启动因子的活化 (CaspMe-2,8,9,12)

非

AIF

完成阶段

依$的途径        Cmbp说完成因子

(CanpMe-3,6,7) Granzyme B   »

(线粒体依賴的）（非线粒体依_的\ 未^核酶 大DNA片断

CAD/ICAD(其它 Dn«»e8)

I

核小体DNA片断

细皰瓦解

图5-4细胞的凋亡过秤

(引 d : Kiihn K*等.Osteoarthritis and Cartilage;!

». 2004)

软骨细胞凋亡时细胞变圆.与周围细胞脱离，失去微 绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并弓细胞肢融合。核 染色质密度增高呈半月形凝聚在核膜周边，核仁裂解₃

电镜下可观察到由细胞膜内陷分割为多个有膜包裹、内 涵物不外泄的细胞凋亡小体。在生物化学上，细胞凋亡 时由于Ca^zVMg²⁴依赖的核酸内切酶活化使核染色质 DNA降解成180〜200bp的寡核苷酸.从而在琼脂糖凝 胶电泳中呈特征性梯状丨)NA图谱。凋亡细胞的软骨区 域糖蛋白减少，凋亡小体产生焦磷酸盐。磷酸盐离子具 有诱导成熟过程中特定阶段的软骨细胞凋亡的作用，而 且还与软骨细胞成熟和细胞外基质矿化有关，它能加速 基质中钙的沉积。

死亡剌激因子激活下列任意一种细胞死亡途径：线 粒体途径、死亡受体途径或是FJR应激途径都M启动细 胞的程序化死亡过程。这些途径的活化通常引起caspase 启动因子的活化，caspase依赖的细胞程序化死亡茁要 caspases完成因子将包括丨CAD在内的下游底物裂解，这 使CAD的活化，导致核小体DNA裂解为小片断，这些小 片断通过凝胶电泳可被分离为梯形DNA图谱。线粒体 途径在ca.spa.se活性受抑制的情况下仍能引起细胞的死 亡，这种情况下凋亡的完成阶段是非caspase依赖的。例 如：凋亡诱导因子（A丨F)的释放可以启动非caspase依椟 的凋亡过程的完成，A丨F位于线粒体内胰与外腴之间。 通过向细胞膜的转移，一种目前尚不淸楚的信号引起染 色质的聚集，以及大的染色体DNA片段的形成，最终引 起细胞的死亡，这一过程不受z-VAD.fmk.的抑制。另 外一种非caspase依赖的调亡途径是granzyme B催化下 完成的，granzyme B对caspase有活化作用，已证实它能 直接裂解ICAD，这表明caspase依赖的凋亡途径是 granzyme B凋亡途径的补充。上述途径最终导致了细胞 的程序化瓦解。

细胞核降解是软骨细胞凋亡的一个重要步骒，这一

过程受 CAD ( caspase activated deoxyribonuclease)或 DFT40(DNA fragmentation factor 40)的催化，GAD 和 DFF40都是镁依赖的脱氧核糖核酸酶。CAD在核小体 间（micleosomes)的组蛋白H1结合区域内将核DNA裂解 开，产生多种双链的、具有180个碱基对的DNA片断，通 过凝胶电泳可将这些片断分成特征性的梯形条DNA阁 谱。在细胞的凋亡过程中，也产生50〜300kb的大的 DNA片断，这种DNA片断被称为大DNA片断（domain sized DNA fragmemation),它在无核内DNA裂解的情况 下也能产生，说明在凋亡过程中存在另外一种核酶（Nu­clease) 的催化作用。

Capases的活化是凋亡的另外一个关键步骤。Cap- sasc的活性可被Ca psasc特异的多肽抑制因子抑制，也〇 J 被Pan - caspase抑制W子（如z - VAD、fmk)所抑制。通 常情况下，Capsase抑制因子对DNA裂解为核小体DNA 片断冇抑制作用，但它不能阻碍这些细胞发生其他形式 的程序化死亡。在细胞核中，无活性的CAD形成一个抑 制因子复合物，带秦丨CAD( caspase - activated deoxyribo- miclease)诳白抑制因子，这一因子也被称为DNA片断因 子 45 ( DNA fragmentation factor 45，DFF45)。活化的 Capsase — 3可以裂解ICAD,便于CAD形成其活性形式，诱导核小体DNA片段的形成。

1CAD的降解、凋亡的DNA梯形图谱的形成不仅只 取决于caspase的活性，也可通过granzymc B催化。这是 —种非caspase依赖的催化方式，granzymc B是一种天门 冬氨酸特异的丝氨酸蛋白酶。非caspase依輓方式所形 成的DN A片断调亡诱导因子（apoptosis indue丨ng fac­tor, AIF) 介导的细胞死亡有关，AIF 是一种线粒体黄素 蛋白，通过诱导细胞凋亡，转移至细胞核.诱导第I阶段 的染色体聚集及大DNA片断的形成。在应对丨)NA损伤 姐的情况F，多ADP核糖聚解（poly - AI〕P ribose poly­merase, PAKP) 能启 动线粒体释放 A1F。成都华西华科研究所研发生产QCT定量CT骨密度体模软件分析系统  
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