成都华西华科研究所分析骨质疏松症模型研究中的分子生物学新技术与QCT骨密度软件体模检测骨质疏松症模型研究中 的分子生物学新技术（New molecular techniques in models for osteoporosis)

一、从骨中提取核酸（Extration of nudenic acids from bone)

从骨中提取核酸进行基因表达分析，对肿瘤和其它 病理组织进行基因突变分析，或为不能提取核酸的组织 提供资料参考，有几种方法可提取核酸且提取试剂盒可 以买到，如果提取大量样品的核酸，用以下的方法提取核 酸比较合适。成功地从组织提取核酸基于四个步骤：破 碎于组织使提取试剂充分与细胞接触；裂解细胞膜使核 酸释放；从细胞内容物中分离出核酸；沉淀和溶解核酸。

(一）材料（见注意事项1)

器械：研磨和粉碎骨的冷冻研磨机，消毐的解剖刀、 剪子和骨钳，提取核酸35mm直径的组织培养皿。

DNA提取缓冲液：17.6mL柠檬酸钠(0.75M，_PH7. 0), 26.4mL SDS(10%), 250g 异硫氰酸胍溶于 293mL 双蒸水中，混匀，临用前加7.2/iL p巯基乙醉于裂解液中 (见注意事项2)。

有烟硅藻土：从包埋或干燥骨中提取DNA。

在lOOmL双蒸水中混悬50g无烟硅藻土，搅拌lh 后自然沉降lh，吸取上淸离心（6 000g，10min>后，去上淸 将沉淀重悬在25〜30mL双蒸水中，加人50%的浓硝酸， 引起烟雾后冷却，再离心（6 OOOgJOmin)后，用双蒸水洗 涤沉淀直至洗涤液的pH为7.0。加一倍的双蒸水制成 泥浆储存（见注意亊项3)。

硅藻土洗涤液：加157,6mg的Tris-HCl和70.92g 的异硫氰酸胍到100mL的双蒸水中。

DEPC处理水：用双蒸水制0.1% DEPC,在371：处 理丨2h,高压蒸汽去除DEFC,在高温下DEPC水解。

溴化乙啶：在10tnL双蒸水中加人100mg的溴化乙 腚，避光保存。

氣仿，乙醉，异丙酵。

1.  5MEDTA:在 300mL 双蒸水中加人 93.05gED- TA,用10M氡氧化钠调整pH为8,加水调500mU

1M Tris:在800mL双蒸水中加人212gTris,用浓盐

酸调整pH为8,加水调至lOOOinL。

Tris- EDTA: lmL 的 1M Tris 与 200/zl 的 0• 5M EDTA混合，加水调至100mL。

3M醋酸钠：在800mL双蒸水中加入401.8g醅酸 钠.用冰醋酸调整pH为5.1，加水调至lOOOmL。

(二）方法

2.  从骨中提取DNA这种方法可从新鲜或冻存的 骨中提取到80kb的DNA，多数DNA来源于骨髓细胞 中，如检测基因突变这种方法不适用。

1.  将骨样品放入盛PBS缓冲液的无菌容器中，在 1〜2h后拿到实验室（见注意亊项4)。

2.  把样品放在培养皿中，用剪子或骨钳分离lcm³ 的组织。

3.  加人lmLDNA提取缓冲液后DNA提取缓冲液 匀浆直至获得无组织块样品。

4.  将上步溶液50(VL转移至1.5mL Eppendorf离 心管（Ep管）内。

5.  加人500/xLTris平衡酚，再加人500_M丨氣仿，混 匀（见注意亊项5)。

6.  离心（10 000g，20min)。

7.  吸取上层水相于另一 Ep管内，注意不要破坏中

间层。

8.  加入1倍体积的异丙醉，并加入1/丨0体积的醋 酸钠溶液（3mol/l,pH5.2),馄匀后置冰内15min。

9.  离心（10 000g，20mir〇来沉淀DNA(见注意亊 项6)。

10. 吸弃上淸，不要碰沉淀，再加人1.5mL的冷乙 醉后离心（10 000g，5min)。吸弃上淸后再洗涤。

11. 用10〜50/iL水或Tris- EDTA缓冲液溶解 DNA,测定紫外吸收定S(见注意事项7)。

12. 在-200C以下储存DNA。

3.  从细胞中提取DNA从细胞中提取DNA不需匀 浆，因为细胞可用裂解液中的盐或变性剂来裂解。

(1)倒掉培养上淸。

(2〉用PBS洗涤细胞。

[16]    75mL的培养瓶中加人lmL DNA提取缓冲液， 晃动培养瓶使DNA提取缓冲液接触所有细胞，作用 lmin,收集细胞。

[17]    将上步液体500/xL转移至1.5mLEpp_endorf离 心管（Ep管）内，晃动Ep管充分裂解细胞。

[18]    同上的(5)〜（12)。

太从包埋或干燥骨中提取DNA干燥骨如考古时 的样品，只有少景细胞DNA,以下方法可使用这些样品。 但注意得到的DNA主要是线粒体DNA,这项技术基于 硅藻土吸收核酸的特性。这个试剂盒（硅藻土吸收试剂 盒）可以从Roche，UK，East Sussex公司购买。

[32]    在液氮中将骨研磨成粉末，可用研钵或研磨机 研磨。

[33]    加人0.5mL DNA提取缓冲液至1.5mLEppe- ndorf离心管（Ep管）内，将100〜500mg骨粉末加至Ep

管内，保证所有骨粉末被湿润。

(3>在冰浴中匀浆24h。

(4>典心（H)000g,5min)沉淀，将上洧转移至另一Ep 管内。

4.  将50//L有烟硅藻土加人上淸中，在冰浴中匀浆 lh〇

5.  将吸收核酸的有烟硅藻土离心沉淀（6 000g, 5min),吸弃上淸（见注意事项8>。

6.  加入lmL硅藻土洗涤液，来回翮转离心管内重 悬硅藻土。离心沉淀(6 000g,5min),吸弃上淸。

7.  用95%乙醉重悬沉淀以除去盐离子，来回翻转 离心管，离心沉淀(6 000g,5min),吸弃上淸（见注意丰项 9)。

8.  重复步骤8。

9.  用lOOpL的10mM Tris或双蒸去离子水甫悬 沉淀将DNA从硅藻土中分离出来（见注意事项10)。

10. 在 56X：中反应 lOmin,离心沉淀（6000g,5min) 硅藻土，将上淸转移至另一 Ep筲内，在-70X：以下储存。

13. 从讶中提取RNA

[19]    将骨样品放人盛PBS缓冲液的尤菌容器中，在 30min后拿到实验室（见注意事项11)。

[20]    把样品放在培养皿中，用剪子分离出lcm³的组 织（见注息事项12)。

[21]    加人1.5〜丨.75mL RNA提取缓冲液后，用剪 子或骨钳将组织剪为浆状，用解剖

刀将组织切割成匀浆。

[22]    将上步溶液1.5mL转移至2mLEpp_endorf离心 管(Ep管）内。

[23]    加人1/10倍体积的氣仿，混匀15sec,在冰浴中 反应5min〇

[24]    在 4X：中离心（10000g，20min>。

[25]    吸取上层水相于另一 Ep管内，注意不要破坏中 间层（见注意13)。

[26]    加人1倍体积的异丙醉，来回翻转离心管6次。

[27]    在冰浴中放置15min沉淀RNA(见注意事项

14)。

[28]    在 4X：中离心（10000g，15min)沉淀 RNA,吸弃 上淸（见注意15)。

[29]    用lmL冷的75%的乙醉重悬沉淀，离心沉淀 (10 000g,5min),吸弃上淸。

(12>重复步_ 11。

[34]    在空气中干燥3~5min,注意不要将沉淀干燥。

(14>根据沉淀体积用DEPC水溶解沉淀。

(2)    用紫外分光光度计或凝胶电泳定里RNA(见注 意亊项16)。

(3)    在-70X：以下储存。

14. 从冷冻骨中提取RNA

如果样品在-70X：以下储存，，可用研钵或研磨机在 液氮中将骨研磨成粉末。

(1)可用研钵或研磨机在液氮中将骨研磨成粉末

(见注意亊项17)。

[35]      将粉末转移至2mLEppend_〇rf离心管（Ep管）内， 加人1.5〜1.75mL RNA提取缓冲液后，来回翮转离心 管混匀样品，在冰浴中放S。

[36]      以下步骤与下级中的步骤5- 16(见注意亊项

18)。

15. 从组织培养细胞中提取RNA RNA Exuation from

Cultured Cells

(4)  倒掉培养上淸。

(5)  用10mL PBS洗涤细胞。

(6)  75mL的培养瓶中加人lmL RNA提取缓冲液， 晃动培养瓶使DNA提取缓冲液接触所有细胞。

(7)  来回吹打细胞.将液体收集到2mLEpp_end_〇rf离 心管(Ep管）内。

(8)  用枪尖吹打混悬液裂解细胞。

(9)  以下步骤与下段中的步隳5~16同。

3.注意事项

[45]      实验中所用的卩巯基乙醉，氣仿，苯酚应在通风 橱内操作以喊少接触这些溶剂。DEPC有致癯性应正确 操作，建议用液体滇化乙啶以减少接触突变剂。

[46]      用的化学试剂应为生化纯，在4C保存3个 月内。

(3>存液在-70X：以下储存，一周内使用。

[37]      提取的DNA可在-20X：以下储存。

[38]      涡旋振荡引起DNA长链断裂。

(6>标记Ep忏以确定DNA在管内位H.DNA沉淀 应在管底可见。

(7>将DNA用双蒸水200倍稀释，将RNA用双蒸 水100倍稀释，在260nm和280nm处测定吸收度。Ho- echst 33258是DNA特异的染色剂，可定董DNA。可用 荧光计在激发光350〜363nm发射光410〜480nm处检 测建立DNA的标准曲线。DNA和RNA的完整性可用 肴家基因做PCR来鉴定。

(1)  可将上淸保存在新Ep讶内直到确信核酸提取 成功。

(2)  用冷乙醉重悬沉淀时应来回翮转离心管混匀使 洗涤充分。

(3)  将DNA从硅藻土中分离出来的缓冲液的_PH

应大于7.5。

(4)  提取RNA要确保RNA酶不裂解RNA，一般不 在30min内提取RNA,应在液氮中或-70t：以下冷冻后 再提取。

(5)  所有步骤应在无RNA酶的环境内，应一直带 手套且经常替换，所有液体应无RNA酶，用DEPC处理 器、Ep管和枪尖，或在180X：干烤2h,也可用RNA醃灭

活剂。

(6)  上淸中含有RNA,中间层含有DNA,下层中含 有脂质和蛋白呔。

(7)  可在-20X：保存，加入糖顷珂有助沉淀RNA。

(8)  记Ep管以确定RNA在管内位

11. KNA在260nm和280nm处测定吸收度的比值  台，使终点荧光强度可能较预期的耍低，而CT值則不受

在1.8-2.0内则纯度较好，如果纯度不好可进行二次提 平坦斜率和早期平台的影响，因此取CT值进行定ft分

取。骨样品一般要进行二次提取。在RT-PCR前用不 析具有较宽的定最检测范围。

含DNA酶的RNA酶处理样品可除:fc DNA。

12. 研磨时可将液氮倒在样品中。

洗涤细胞时重恳细胞，离心（400g，10min)后吸 弃上淸。用l.SmLRNA^om：*：悬沉淀，用枪尖吹打混悬 液裂解细胞。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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