成都华西华科研究所分析破骨细胞分化因子结构功能与QCT骨密度软件体模检测

破骨细胞分化因子（RANKL/ODF)的 结构及功能

RANKU又称为破卄细胞分化因子（Osteoclast dif­ferentiation factor, ODF)，骨保护因子配体 （ Osteoprote- gerin'⁴gand,OPG - L) .TRANCE(TNF - related activation -inducedcytokine),是近年M新发现的肿瘤坏死因子超 家族的新成员_c该因子由成骨细胞/骨髄基质细胞产生， 在M-CSF的辅助T,RANKL与0C前体细胞表面的受 体一核因子kB受体激动子（Receptor activator of NF - kB,RANK)结合，诱导前体细胞分化、发眘为成熟的OC: RANKL尚可以瀲活成熟的〇C,抑制其凋亡靶向 敲除RANKL基因的小鼠出现骨硬化症；过度表达 RANKL的转基因小鼠表现为骨质疏松症。RANKL的 作用可被其非功能性受体（Decoy receptor)骨保护因子 (Osteoprotegcrin，0PG)阻断。

1. RANKL/ODF/OPG—L 的结构人 ODF/OPG- L是有317个氨基酸组成的多肽，在结构上类似TNF相 关调亡诱导配基（I’NF - relatedapoptosis - inducing-ligandTKAlU。CD40配体同源性为28%,与FasL同源 性为19%。人ODF/OPG-L为II型膜蛋白，无信号肽， 有一胞质部分在N端，山第1 -48位氨基酸组成，跨膜部 分为第49-69位氨基酸，胞外部分在C端为70-317位 氨基酸。

人ODF/OPG-L基因定位于染色体13ql4。鼠的 ODF/OPG-L苺因启动子含有对Cbfa- 1的反应成分， Cbfa-1是OB分化所必须的转诸因子，Cbfa-1基因敲 除的胚胎鼠发穿中长干骨的ODF/OPG - LmKNA也缺 乏，颅盖# OB不能支持OC形成〇

1.  RANKL/ODF/OPG - L 的组织分布 ODF/OPG -LmRNA持续高表达于骨骼.在胎鼠骨骼位于环绕软 骨胚箪、肥大的软骨细胞及初始骨化区和骨改建区；正常 成年骨骼中OPG-LmRNA表达在初始海绵状多孔区、 骨改建血苷区和肥大软骨细胞宥关的细胞。骨骼中 OPG - L的表达部位与骨代谢时OPG- L在局部的作用 有关。原位杂交发现，淋巴组织如淋巴结（弥散）、胸腺 (灶状）、脾脏（灶状）、肠淋巴样斑块ODF/OPG-L呈高 水平表达，在脾脏OPG-L的表达位于白髄区和淋巴结 皮质。心脏、骨骼肌、肺、胎盘及甲状腺也有低水平表达。

与组织分布相对应，不同的基质细胞系如ST2、成骨 细胞系MC3T3、鼠的OB、人的骨髄基质细胞、骨源性肉 瘤细胞系如Sa〇S、ROS都可以检测到ODF/OPG- L的 表达

2.  RANKL/ODF/OPG - L 的生物学功能 ODF/ OPG-L在毋代谢中的功能主要可概括为刺激0C分化， 增强成熟OC的活性，抑制OC凋亡。

只要存在低浓度的M-CSF，ODF就可以直接作用 于OC前体细胞，促使其分化为成熟的OC。表达ODF的 COS-7细胞系COS^ODF&不表达ODF仅表达空栽体的 对照细胞系COS^t分别与鼠牌细胞共同培养7天， COS^f)<)f体系中出现丁RAP,降钙素（（calcitonin CT)受体 阳性多核细胞，而COS^t体系中则无多核细胞形成，表 明ODF介导f OC形成过程中所必须的细胞一细胞间 信号。Lacey等报导人293成纤维细胞表达的重组ODF 存在膜结合性和可溶性两种形式,OC前体细胞与基质细 胞直接接触也是连续暴雜于膜结合性的0DF之下，可溶 性的ODF以旁分泌和内分泌的方式发挥作用。M-CSF 对ODF诱导OC形成是不可或缺的承要因子。

OPG-L尚能直接促进OC在牛骨片上形成骨吸收 陷窝，促进Ca²•释放。Burgess等研究表明无M-CSF存 在，OPG -L也可使分化发育成熟的OC超傲结构改变 (如细胞骨架歌新排列，形成actin-rinRs)及骨吸收陷窝 形成。

将重组OPG-L/ODF直接应用于正常鼠，1天之内 便口丨以出现严重的高钙血症，而且与OPG-L的剂进有 关，3天有明显的骨摄丢失；OC体积大，皱褶缘面积广但 OC的数M并未增加，这表明OPG - L激活已经存在的 OC而并未增加OC形成。OPG-L/ODF不仅对钟矿代 谢有影响，对T细胞和网状细胞也有调节作用。OPG-L基因敲除鼠的B和T淋巴细胞成熟有缺陷、胸腺及淋 巴结都发育不良〇 OPG- L/ODF即TRANCE'RANKL， 可以激活T细胞的c-JunN木端潋酶（JNK).结合到成 熟的网状细胞表面，向_且丁RANCE通过提商抗凋亡分子 bd-Xl的表达而抑制网状细胞的凋亡。RANKL可诱 导网状细胞放形成，促进网状细胞对T细胞的作用，及细 胞因子对T细胞生长的效应。

OPG-L箪因敲除小鼠发生严重的骨硬化症，长骨 短小，牙齿萌出瘅碍，成熟OC缺乏；由于骨化增加长骨 骨髓腔狭窄，导致代偿性讶髄外造血。

如前所述,()PG- L/ODF在OC形成的全过程一分 化、融合及存活、激活一都有作用.而且每一阶段的作用 都可以被OPG/OCIF所抑制。

(四）   OPG、OUF调控骨吸收的作用机制

ODF直接作用于OC前体细胞，表明在OC前体细胞表面存在（)丨)F的膜结合受体（ODAR)。Nakagawa等 从鼠OC前体细胞cDNA文库中克隆到ODAR.核苷酸序 列分析表明〇[〕AK及RANK。RANK也是新发现的 TNFR家族成员，调控网状细胞的功能。RANK是一种1 甩跨膜蛋内，人的RANK包含616个氨基酸，有一信号 肽由28个氨基酸组成，N端的细胞外区域由184个氨基 酸组成，跨膜域较短（21个氨基酸），C端的胞质部分很 大，由383个氨基酸组成。编码人RANK的基因位丁染 色体18q22.1。RANK的胞外域包含4个亩含半胱氨酸 的pseudorepeats和两个N -糖基化位点，展于典塑的 TNFR超家族成员结构。RANK与CD40冇40%的同源 性。RANK的表达组织主要局限于网状细胞、B淋巴细 胞、丁淋巴细胞系及成纤维细胞，在骨组织中主要存在于 OC前体细胞。

ODF和RANK(ODAR)之间有高度特异性和亲和 力。二者结合激发了细胞内的一系列级联反应.包括于 TNFR相关因子（TRAF)家族成员之间的相互作用，激活 转汆因子NF - icB,促进蛋d激SUNK的活性 RANK/ODAR胞外域的抗体的作用与ODF相W ,促进 OC生成。NF-kB丨和NF-kB2双敲除的小鼠也发生骨 硬化病,〇C生成减少。这些结果表明在OPG-L/ODF 作用中，NF-»cB是关键的转录因子。转录子_c-f〇s与c -jun形成同躲二聚体共同调控基因。若靶向敲除_c-|〇s 也会导致OC生成障碍。

总之，RANK是ODF介导OC生成的信号受体。 OPG通过与ODF结合阻断0DF与RANK的结合而抑 制ODF介汙的OC生成。但OPG对抗RANK抗体接到 的OC形成无抑制作用。这表明〇PG/〇CIF是ODF的 非功能甩受体，竞肀性对抗RANK：^

(五）  OPG /〇aF、OPG - L /ODF 对骨代谢 的调控机制

Hofbauer等研究了人类3种OB细胞系OPGmRNA 的表达受 VitD3、BMP-2 ,IL - lp、TNF-〇 彩响，结果M 示VkD3(10 ⁷M)增加人胚胎成#细胞系（hFOB)和正常 trabcular成骨细胞（hOB) OPG/OC〗FmRNA的表达（分别增加90%和5090,但不影响骨髄基质细胞系（hMS)中 OFG/〇C：IF mRNAMo糖皮质激素诱导的骨质疏松是令身应用糖皮质激索 所引发的最常见也是锻严1的并发症，但其导致#吸收 的机理一直不能确定◊ Hofbauer等采用Northern來交、 逆转录 PCR(reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR)、EUSA方法检测了糖皮质激素对几种不同 的人成骨细胞系OPG、OPG-L的调控。结果显示，地塞 米松（Dex)抑制基质细胞（humanstromalce丨IshMS)、成骨 细胞（humanprimarytrabecularosteoblasthOB)、胚胎成骨细 胞（hFOB)和骨肉瘤细胞MG-63中OPGmRNA的表达 (70% — 90%),呈现时间、剂M依赖性，并以同样方式抑 制 OPG 蛋白分泌(88%P<0.001，Dex_:10^_u>〜l(T⁷M)_; 同时Dex促进hMS和hFOBOPG- LmRNA转录水平（2 和4倍）。以Dcx预处理的MG-63细胞的条件培养基 作鼠骨髄培养，可显著增加TRAP的活性（P<0.005)及 TRAP阳性多核细胞败（P<0.001)。雌激索缺乏件骨质疏松是妇女绝经后高发病。雌激 素与OB和OC系细胞上的受体结合，通过旁分泌机制喊 少促进骨吸收因子的产生（如比-ip、TNF-a、IL-6、M -CSF和PGE2)，增加抗骨吸收W子的分泌（如丨L- 1受 体拮抗剂、TGF-p等）。但这些因子如何介导雌激素的 效应呢？

OPG防止去卵巢大鼠骨M丢失，提示OPG为介导雌 激索作用的又一新候选成员。Hofb_aue^t；^等发现丨7尽- 雌二醣（17p-estradiol 17P-E2)呈时间、剂童依赖性增加 hFOBOPGmRNA 和蛋白的儇（370 %、320 % P < 0. 001)。 17p - E2对OPG的作用可完全被雌激索拮抗剂ICI182、 780所阻断Srivasnw等发现雌激家通过F调JNK丨的活 性减少鼠骨髄单核细胞及RAW264.7单核细胞系分化 为OC。丨活性完全丧失导致c-F〇s和c-Jun的核 水平下降，从而使这些转录子结合DNA的能力下降，OC 前体细胞对RANKL的反应F调。

关于1L- 6对OPG/OCIF和ODF/OPG — L的作用 颇有争议。有学者认为IL-6不影响OPG的合成，对人 骨髄基质细胞和MG-63细胞OPG- L/ODF转录水平 无任何影响。丨L-6对人牙周膜细胞OPG无作用。Ack- banio等近来发现丨L-6通过提高骨吸收局部钙离子浓 度，增加OC对钙离子的敏感性而直接激活OC。

风湿性关节炎患者骨质破坏是治疗中的一大觫手问 题。Lubberts等报导重组人5型腺病毒栽体引发的局部 IL-4过度表达（八〇15£丨111丨1^-4),可咀止患有关节炎小鼠 的膝关节损害和骨质破坏。尽管关节局部炎症仍然存 在，八〇15&1₁₁比-4可防止骨侵蚀及减低丁1^^活性，表明 局部IL-4可以抑制OC形成，滑膜组织中IL-丨7、丨L- 12、CK的mRNA表达受抑制，丨L-6、丨L- 12蛋白减少， OPG- L的表达受到Ml抑制，但对OPG表达无影响。

IL18也是OB分泌的一种细胞因子，能抑制〇C 形成，IL ^_ 18虽然可促进干扰素-"/(interferonIFN - "/) 产生，但其抑制OC形成却是作用于T细胞产生粒-巨睡细胞克降刺激因子（eranulocyte/macrophage co丨ony ^- stimu丨ating factor GM ^_ CSF 而实现的。近米，Makiishi ^_ Shimobayashi等报导丨L- 18对OPGmRNA的表达有上 调作用。将丨L _丨8加人到鼠骨髓基质细胞ST2、 MC3T3 -E1及颅盖骨OB的培养基中，3h后OPGmRNA 的表达即达最大程度上调，但对OPG- LmRNA转录水 平无影响。与之相应，上述细胞系都表达IL-18受体两 种组分的mRNA及IL- 18倌号整合分子MyD88。此结 果显示OPG是IL-18抑制0C形成时发挥作用的靶因 子之一。

由此可见，成骨细胞或骨髓基质细胞在0C分化、激 活过程中起重要作用，0PG/0CIF及RANKL/ODF/OPG -L为其他因子、激素、药物调节骨代谢的核心因子。骨 微环境中RANKL与OPG表达金的相对比值决定着骨 代谢的方向，正常生理悄况下，RANKL与OPG的表达里 相对抗衡，骨吸收与毋形成处于平衡状态；若RANKL的 馕超过OPG,曾代谢则倾向于骨吸收方向，反之，OPG的 表达相对多于RANKU骨形成超过骨吸收^[~。据报道， 绝大多数可影响0C生成、调节骨代谢的亲骨性因子如前 列腺索、l,25(OH)₂D₃等，其作用是通过结合到成骨细胞 或骨髄基质细胞表面，最终全部或部分ff:集到OPG和 RANKL水平，上调（或下调）RANKL(或OPG)的表达而 间接实现。虽然有关KANKL/OPG表达的变化与牙槽 骨或颌骨吸收关系的研究尚未见报道，但是，这一理论为 进一步研究牙槽骨和颌骨的吸收机制提供了新的思路， 为颌骨骨吸收的防治提供了新的依据和方向。

影响骨代谢的细胞因子和激素主要通过以下3条途 径来调节OC的形成和活化：VitaminD3受体 [l,25(OH)₂D,]通路；蛋白激酶A途径【甲状旁腺激素 (PTH),前列腺索（PG)E2】即130通路[白细胞介素 (lL)-6、丨L-111。无论哪一条途径其效应最终全部或 部分汇集到OPG和ODF水平，此为“汇集假说”。在这 个新的调节OC生成和骨吸收的模型中，RANKL与跨膜 受体RANK结合启动了一系列信号级联反应，最终导致 OC分化和活化。OPG作为可溶性的饵受体能与 RANKL结合，破坏OB或基质细胞与OC前体细胞间的 作用，因而抑制OC的形成和成熟。OB/基质细胞合成 RANKL和OPG的功能受多种钙调节激素和细胞因子的 调节，但是RANKL和OPG是作用于骨吸收和钙代谢的 最后体液介质。

亊实上，RANKL和OPG表达的比例决定骨吸收的 程度；过歎的RANKL增加骨吸收而过童的OPG抑制骨 吸收。以下亊实同样证明了这条信号途径的生物学東要 性：操纵小鼠这三个基因的表达，形成了严重的骨质疏松 和骨硬化两个极端的骨骼表型。OPG过度表达的小鼠 可引发石骨症（osteopetrosis),也称大理石骨;OPG基因缺 陷小鼠可发生骨质疏松。反之,RANKL过度表达的小鼠 可引发骨质疏松症；敲除小鼠KANKL基因，则可发生石 骨症。这条信号途径的若干个基因突变形成了几种少见 的人类遗传性骨骼疾病，例如骨硬化症、溶骨症等。已经证明，绝经后骨质疏松、与背丟失相关的类风湿性关节 炎、肿瘤骨转移和恶性肿瘤的高血钙等代谢性骨病的发 病机制包括OPG/RANKL/RANK的信号途径紊乱。

(六）OPG是抑制破骨细胞骨吸收功能的核

心因子

采用脾细胞和骨髓基质细胞共培养体系，Smonet等 发现重组人OPG二聚体在浓度ln_K/mL时抑制约50% 的OC分化，当浓度达到丨0〜lOOng/mL时出现完全抑 制，判断标准为抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性和细 胞化学。Tsuda等从胚胎肺组织成纤维细胞条件培养基 中制备的单聚体和二聚体OPG在1〜40ng/mL时可抑 制OC分化，半最大抑制浓度为4〜6ng/mL。分析OPG 的蛋白结构与功能的关系发现，修剪OPGN端到185位 半胱氨酸可灭活该分子，但去除C端到194为氣基酸尚 不影响其活性。由此可知，OPG的N端包含TNFR类似 域，足以发挥其对OC生成的抑制作用，也是其活性必须 的结构。OPG 也可以抑制 l,25(OH>₂D;、PGE2、PTH、 儿-1或丨L-11诱导的OC生成◊体外实验结果还表 明,OPG抑制成熟OC性骨吸收陷窝形成.拮抗1,25 (OH^DbPGES'PTHJL- Id 及 RANKL 引起的骨吸 收；与其抑制OC分化的效应相比，抑制成熟0C活性的 浓度要高得多（50〜lOOOng/mL)。

体内实验表明，过度表达OPG的转基因鼠出现严重 的骨硬化症，骨髄腔窄小。组织学发现矿化的小梁骨增 加,OC数M减少，但牙齿萌出、淋巴细胞、淋巴器官发育 无缺陷。在RANKL基因敲除的小鼠则存在牙齿淋巴系 统异常^原因可能为转基因鼠OPG仅在出生后被激活， 于是RANKL的效应在胚胎发育过程中仍存在；而 RANKL基因敲除鼠其RANKL基因在胚胎发育过程中 完全失活。靶向敲除OPG的小鼠发生严重的#质疏松， 股骨生长板破坏，前两个月复合型骨折，而且出生后死亡 率升高。OPG缺乏的成年小鼠有一系列脊柱压缩性折 裂和股骨骨垢埸陷。2月龄OPG缺乏鼠骨密度与同龄 野生型对照组相比，低19% (皮质#)和45% (小梁骨）。 到3月龄时，雄性小鼠骨的抗弯曲力低50%。重组OPG 还可以保护大鼠由于卵巢切除引起的骨量丢失。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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