成都华西华科研究所分析颌骨骨吸收分子机理研究与QCT骨密度软件体模检测

颌骨骨吸收分子机理研究（the molecular mechanisms of mandiblere sorption)

最新发现的RANKL- RANK-OPG环路被认为是 调节OC分化和活件的终极通路。各种刺激骨吸收的因 子作用于成伢/基质细胞，诱导其细胞膜表达RANKL分 子，通过其与OC前体细胞膜上受体RANK的A；接结合， 将信号传人OC前体细胞，引起级联瀑布反应，使OC分 化成熟和激活。而OPG则由成骨/基质细胞旁分泌发挥 作用，竞争性地与KANKL结合，封闭RANKL和RANK 的结合，抑制OC分化成熟。因此，RANKL/OPG的比值 是决定OC分化诱导的关键。

(一）OPG'KANK 及 RANKL 的发现

1997年，Simonet等克降出一种TNF受体（TNFre- ceptorTNFR >超家族新成员，称为It保护因子（osteoprotc- geriri,OPG)^h4、间年，冇学者也从人成纤维细胞的条件 培养基中分离纯化到一种可以抑制破背细胞形成的破骨 细胞生成抑制因子（osteoclastogenesiis inhibi，OCIF)。随 后，乂发现TNFR家族新成员TNFR分子丨（TKl)^h51。 通过序列分析证明〇PG、0CIF和TR丨氨基酸序列相同。 目前国际矿化组织将其同一命名为#保护因子OPG。 研究表明，7天大的OPG去基闪小鼠已忠有早发性骨折 和进行性椎骨畸形。年长OPG杂合与纯合基因塑去基 因小鼠的骨小梁骨密度降低。

同年，R本的SudJM等发现，OPG结合的4〇kd的蛋 白为OPG的配苺，即破骨细胞生成因。子（〇^6〇<^1_〇- genes丨s differentiation factor,ODF),并将其成功分离出来₀ Lacey等》从鼠#髄单核细胞系32D细胞克隆出OPG 的配基（OKTgand OPG - L”），并证明 ODF 与 OPG—L 为同一种蛋白。分子克隆发现ODF/OPG-L与以前克 降出的 TNFR 家族成员 TRANCE(TNF•—relatedactiva- tion—induced cytokine) ffl RANKL(receptor activator of NF-»cBkg_and)^D8相同。目前闻际矿化组织将其同〜命 名为破骨细胞分化因子RANKL。RANKL是目前发现 的唯一能直接诱导破對细胞分化发育并参加破骨细胞功 能调节的细胞因子。只要存在低浓度的M—CSF, RANKL就可以直接作用于OC的体细胞，促使其分化为 成熟的OC而无需OB/基质细胞介导。丨司时，RANKL介 导了 OC形成过程中所必须的细胞一细胞间信号，而且 是介导OC生成及功能信号传导的最终因子。

随后，Anderson等首先发现NF — KB配体受体活化 因子RANK^[W1。这一发现证明f破骨细胞的发育与成 骨细胞密不"了分。RANK是RANKL唯一的0C受体。 实验表明，当采用不能透过细胞、只能透过可溶W子的生 物膜将成骨细胞和破骨前体细胞分开培养后，不能产生 具有活性的破背细胞。这一现象同样说明，破骨细胞和 成骨细胞相互接触是破骨细胞生成、活化的必耍前提条 件。去基因研究结果表明，RANK去基因小鼠没有牙齿， 或者可能患有严重的骨硬化症，或者表现为低钙血症和高甲状旁腺家症。

以上三个W子的发现使破骨细胞的研究进入一个崭 新的阶段，OPG/RANKL/RANK环路迅速成为调控骨代 谢的核心因子。

(二）骨保护因子續骨细胞分化抑制因子 (OPG/OCIF)的结构与功能

1. OPG/OCIF的结构 OPG又称为破骨细胞分化 抑制因子（Osteoclastogenesis inhibitory factor，OClF)，也足• 新近发现的TNF受体超家族中的一员，在体内、体外均 可以阻断OC的生成和功能。过度表达OPG的转基因 鼠患非致命性骨硬化症，粑向敲除OPG基因的鼠发生骨 质疏松症。

OPG/OC丨F/TR1是一种肝素结合搪蛋白，由401个 氨基酸组成，N端的前21个氨基酸为信号肽，其余380 个为成熟肽，N端包括四个亩含半胱氨酸的冈域（DI- D4),在结构上与TNFR家族TNFR—2、CD40的胞外区 最接近：C端有两个死亡N)源域（deathdomain - homolo- gous DDHD5 - D6>，其I)DH域在结构特征上与调节凋亡 信号的P55、Fas、DR3和TRAIL受体的死亡域相同， P55、Fas、DR3和TRA丨L都逋于TNFK家族成员

2.0PG/0CIF 的组织分布 OPG/OCIF mRNA 组织 分布广泛，不仅局限于骨组织和免役组织。以Northern 杂交可以从肺、肾、肝、抜部、肠、皮肤、脑、脊索、甲状腺、 胎盘和颅骨检测出高表达的OPG/OQFmRNA。

在鼠的胚胎发育过程中，OPG/OC丨F mRNA在第7 天就可以检测出高水平表达，笫11天开始降低，从15天 表达又增加。发育15天的鼠OPG/OCIFmRNA主要表 达于发育中骨的软骨部分，如上下颌骨、舌骨、枕骨、肋 锌，脊柱，其他如头臂动脉、导管，左主支气宵，败主动脉， 中肠都有表达。

人组织中OPG/OCIF mRNA表达方式和鼠组织中 有明显不N.尤其在脑、肝、肾.顷因尚不明确，但反映出 种域间的差异。

多种不同的OB样细胞系包括骨餹基质细胞系、成 骨细胞系和骨肉瘤细胞系MG63、内皮细胞、动脉平滑肌 细胞、成纤维细胞、卵巢的CADV- 3、乳腺癌细胞系 (MCF7)、单核树枝状B淋巴细胞系都表达OPG/OCIF- mRNA〇^l2,]

1.  OPG/OCIF生物学功能 OPG/OCIF是一种可 溶性蛋白，作为OPG- L/ODF的配体，阻止OPG- L/ODF结合OC前体细胞表面的RANK,抑制OC分化的 最后阶段、抑制成熟OC的激活、诱导凋亡。

采用脾细胞和骨髄基质细胞共培养体系，Simonet等 发现重组人OPG二聚体在浓度l_ng/mL时抑制约50%的 OC分化，当浓度达到10〜l〇〇_ng/mL时出现完全抑制， 判断标准为抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP)的活性和细胞 化学^ Tsuda等从胚胎肺组织成纤维细胞条件培养基中 制备的单聚体和二聚体OPG在丨〜40ng/mL时〇丨抑制 OC分化，半最大抑制浓度为4〜6ng/mU分析OPG的 蛋白结构与功能的关系发现，修剪OPG N瑙到185位半胱氨酸》丨灭活该分子，但去除C端到194为氨基酸尚不 影响其活性。由此可知，〇PG的N端包含TNFR类似 域，足以发挥其对OC生成的抑制作用，也是其活性必须 的结构。OPG也可以抑制l，25(OH)₂D;、前列腺家 (PGE2)、甲状旁腺激素（PTH)、丨L一 1或丨L- 11诱导的 OC生成。

OPG/OC丨F抑制成熟OC性#吸收陷窝形成，拮抗 1，25(OH>₂D₃、前列腺素（PGE2>、甲状旁腺激素（PTH)、 IL- la及ODF引起的骨吸收：与其抑制OC分化的效应 相比，抑制成熟OC活性的浓度要高得多（50〜 1000ng/mL)^[22'²⁴³ 〇

OPG可以增加皮肤成纤维细胞增殖，通过结合 TRA比诱导T细胞凋亡。

体内实验表明，过度表达OPG的转基因鼠出现严重 的骨硬化症，骨髄腔窄小。绀织学发现矿化的小梁骨增 加，OC数最减少，但牙齿萌出、淋巴细胞、淋巴器官发育 无缺陷。在ODF/OPG-L基因敲除的小鼠则存在牙齿 淋巴系统异常。职因可能为转基因鼠OPG仅在出生后 被激活，于是ODF/OPG- L的效应在胚胎发疗过程中仍 存在；而ODF/OPG -L基因敲除鼠其ODF/OPG - L基 因在胚胎发會'过程中完全失活。

靶向敲除OPG /OC IF的小鼠发生严重的骨质疏松， 股骨生长板破坏，前两个月复合甩骨折，时且出生后死亡 率升卨。OPG/OC丨F缺乏的成年小鼠有一系列脊柱压缩 性折裂和股骨骨垢埸陷。2月龄OPG/OCIF缺乏鼠骨密 度与同龄野生型对照组相比，低19% (皮质#)和45% (小梁骨）到3月龄时，雄性小鼠骨的抗弯曲力低

_5〇% [25-272 _〇重组OPG可以保护大鼠由于卵巢切除引起的骨tt丢失。

OPG除能调节骨代谢外，尚能调节B细胞的发痒和 功能；保护内皮细胞因生长因子缺乏引起的细胞凋亡。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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