成都华西华科研究所分析2型糖尿病相关位点检测方法与糖尿病早期无创检测诊断方法

技术领域

[1]  本发明涉及疾病相关位点检测技术领域，更具体地，涉及2型糖尿病相关位点检 测方法技术领域，特别是指一种2型糖尿病相关位点检测方法。

背景技术

[2]  2型糖尿病惠也叫成人发病型糖尿病，多在35〜40岁之后发病，占糖尿病患者 90%以上。2型糖尿病患者体内产生胰岛素的能力并非完全丧失，有的患者体内胰岛素甚至 产生过多，但胰岛素的作用效果却大打折扣，因此患者体内的胰岛素是一种相对缺乏。通常 在临床上应用胰岛素释放试验来区别糖尿病的类型，试验时进食75克葡萄糖，空腹及进食 后30分钟、60分钟、120分钟、180分钟各抽血一次测胰岛素及C肽。若空腹血胰岛素及C 肽低于正常，且进食后不增高者考虑为1型糖尿病患者；若空腹血胰岛素及C肽正常、增高 或稍低，进食后有增高但高峰值延迟，则考虑为2型糖尿病患者。

[3]  2型糖尿病是由遗传因素和环境因素共同作用所引起的，属于多基因疾病，由数个 糖尿病基因相互作用所引起的。2型糖尿病患者的病情一般较缓和，由于现在的检测手段过 于滞后，有的患者甚至自觉十分健康。如果对于糖尿病不能早期诊断并给予恰当的防治，将 可能出现各种慢性并发症，如：心、脑血管疾病，病情严重者可造成身残或早亡；下肢血管 病变（糖尿病足，病情严重者需截肢而致残）；糖尿病肾病，晚期需要透析治疗；糖尿病视网 膜病变，晚期可以失明以及糖尿病神经病变所引起的一系列症状和体征，这些并发症的出 现将使糖尿病患者的生活质量严重下降。对此我们应该尽量多了解一些与糖尿病相关的知 识，做到来病先防，有病正确对待并及早调治。

发明内容

[4]  本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种2型糖尿病相关位 点检测方法，该检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，为是否进一步采取有针 对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。

[5]  为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[6]  —种2型糖尿病相关位点检测方法，其特点是，包括步骤：

[7]  a.提取来自人的样本的基因组DNA ;

[8]  b.根据两个2型糖尿病相关基因的序列设计二对引物对，对所述基因组DNA进行 PCR扩增，回收PCR扩增产物；

[9]  c.对所述PCR扩增产物进行测序，并分析测序结果来判断所述两个2型糖尿病相 关基因是否发生突变。

[10]     较佳的，所述两个2型糖尿病相关基因是PRKCZ基因和CAPN10基因。

[11]     更佳地，所述二对引物对分别用于检测PRKCZ基因的rs427811位点，及CAPN10基 因的rs3792267位点。

[12]     较佳的，其中一对所述引物对是SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列。

[13]     较佳的，其中一对所述引物对是SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。

[14]     本发明的创新点在于二个侯检位点的整合，通过选取二个2型糖尿病的侯检位 点，根据PRKCZ基因和CAPN10基因分别设计特异性引物，并对来自人的样本的基因组DNA 进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，设计巧妙、操作简单、检测结果准确可靠，根据二个 侯检位点的具体状况作为2型糖尿病健康管理的主线，监控疾病的发生发展。如果是2型 糖尿病遗传倾向较高或很高的人群，建议减少一切2型糖尿病的外在致病因素，并每半年 进行一次检查，做到早预防，早发现，早治疗，延缓甚至避免疾病的发生。

具体实施方式

[〇〇15] 为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。

[1]   1.基因组DNA提取：

[2]   1.1试剂和仪器：

[3]   1. 1. 1 试剂和耗材：基因组 DNA 抽提试剂盒（TIANamp BLOOD DNA kit，DP318-03 ; TIANamp Micro微量样品基因组DNA提取试剂盒，DP316 ;TIANamp 口腔拭子基因组DNA提取 试剂盒，DP322-03)含：细胞裂解液CL ;缓冲液GA ;缓冲液GS ;缓冲液GB ;缓冲液GD ;漂洗 液 PW;洗脱缓冲液 TB;Carrier RNA;RNase-free ddH₂0;蛋白酶 K(20mg/ml);吸附柱；收集 管（2ML) ;1.5ML无菌收集管。无水乙醇。

[4]   1. 1. 2仪器：DENVILLE260离心机；XW-80A旋涡混合器；H. H. S指针式电热恒温水

浴锅。

[5]   1. 2提取步骤

[6]   从全血中提取基因组DNA

[7]   1. 2. 1取200ii 1的抗凝全血至1. 5ml的Eppendorf管中，如果样本的量少于 200iil，则加入缓冲液GS补充至200iil。如果样本量多于200iil，需要用细胞裂解液CL 处理，具体步骤如下：在样品中加入1-2. 5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10, OOOrpm离 心1分钟，吸取上清，留下细胞核沉淀（如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次），向离心收 集到的细胞核沉淀中加200 ill缓冲液GS，振荡至彻底混匀。

[8]   1. 2. 2加入20 ill的蛋白酶K溶液，混匀，再加入200 ii 1的缓冲液GB，立刻充分颠 倒混匀。56°C水浴样本10分钟，水浴过程中请每隔3分钟上下轻柔颠倒混匀样本，溶液应 变清亮。（如溶液未彻底变清亮，可延长裂解时间至溶液变清亮为止）。

[9]   1. 2. 3加入200 ill无水乙醇，充分颠倒混匀，这时可能会出现絮状沉淀。

[10]  1. 2. 4将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管 中），12,000rpm (〜13,400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

[11]  1. 2. 5向吸附柱中加入500 ill缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, OOOrpm(〜13, 400 X g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

[12]  1. 2. 6向吸附柱中加入700 ill漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, OOOrpm(〜13, 400 X g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

[13]  1.2. 7向吸附柱中加入500 ill漂洗液PW，12, OOOrpm(〜13, 400Xg)离心30秒， 倒掉收集管中的废液。

[14]  1. 2. 8将吸附柱放回收集管中，12, OOOrpm (〜13, 400 Xg)离心2分钟，倒掉废液。

[15]  3•胶回收纯化

[16]  3. 1PCR产物纯化试剂盒：北京博大泰克生物工程有限公司。

[17]  3. 2Kit组成及保存（室温保存）：

[0045]

	50 次（ml)	100 次（ml)
胶DNA吸附柱	50个	100个
溶胶液	40	75
浓缩漂洗液	15	30
洗脱缓冲液	5	10
2.Omleppendorf 管	50个	100

[18]  3. 3准备工作：浓缩缓冲液按1 : 3的比例加入无水乙醇，混匀。盖紧瓶盖保存。

[19]  3. 3步骤（离心使用国产TGL-16B离心机）

[20]  3. 3. 1制胶：用400ml TAE溶液溶解6g的Agarose，终浓度为1. 5% (质量体积 比，1. 5gAgarose/100mlTAE)。用微波炉加热溶解Agarose (可加热两次，每次三分钟，防止 爆沸）。室温冷却至60°C。加入18ul的浓度为10mg/ml的EB，混匀后，将胶倒入一茬好梳 子的胶槽中。待胶彻底凝固，取出梳齿，切下取所需胶孔量用铲子将胶移至胶槽里后再放到 电泳槽中，加入1XTAE。（备注：胶槽每次放到制胶平台时下面都要垫上一次性吸水纸，防 止污染）

[21]  3. 3. 2上样：10uL样品+2uL溴酚蓝染料，混匀，上样。5ul DNA Marker DL2000(北 京天为时代）。

[22]  3. 3. 3电泳：接通恒直流电源，150伏特电压电泳，根据片段大小，电泳15-25分钟。

[23]  3. 3. 4割胶：割下含DNA的Agarose胶块，使它尽可能小，尽可能薄的胶片，放入 1.5ml离心管。尽量去掉不含DNA的琼脂糖，这样对提高质量、简化操作均有利。（备注：将 胶槽从电泳槽里拿出，放在吸水纸上将缓冲液吸干，在紫外台上垫上保鲜膜，用镊子固定胶 块进行割胶，割胶完成后，用镊子将割好的胶转移到离心管中，注意：每转移一个胶块，镊子 都要放到酒精溶液中清洗，以防污染。）

[24]  3. 3. 5溶胶：加入500ul的溶胶液，55°C水浴lOmin，（计时器定时）使胶块完全熔 化，每2min颠倒混勻一次。

[25]  3. 3. 6目的片段<500bp时，加入100ul的异丙醇，混匀。55°C水浴lmin，混匀。目 的片段>500bp时，可省略该步骤。

[26]  3. 3. 7转移：将溶化的Agarose液移入吸附柱，12000rpm离心40sec。倒掉收集管 中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。

[27]  3. 3. 8在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心40sec。倒掉收集管中的液 体，再将吸附柱放入同一个收集管中。如果室温低于20°C，离心前先静置lmin。

[28]  3. 3. 9在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心40sec。倒掉收集管中的液 体，将吸附柱放入同一个收集管中。

[15]     3. 3. 10 在 12000rpm 离心 2min，静置 lOmin。

[16]     3. 3. 11将吸附柱放入一个干净的1. 5ml离心管中。在吸附膜中央加入12〜25ul T1液（根据电泳条带亮度决定），静置5min，12000rpm离心2min。将上述DNA溶液-20°C 保存。如果室温低于20°C，室温静置时间延长至5min，或者50°C水浴静置2min，以确保DNA 完全溶解并洗脱下来。

[17]     3. 3. 12对纯化后的PCR进行电泳鉴定，2uL样品+lul溴酚蓝染料，混匀，上样。5ul DNAMarker DL2000 (北京天为时代）。观察条带的亮度决定BDT反应模板用量。

[18]     4测序反应

[19]     4.1 试剂

[20]     50% BigDye terminator 3. 1 (100 u 1 BDT+100 u 1 BDT Buffer);双蒸水；醋酸钠 / 乙醇溶液（3N NaAC 2.5ml+E0H 37.5ml) ;70% (_20°C冷冻）乙醇溶液。

[21]     4. 2反应操作流程：

[22]     4. 2. 1 将所有特异引物稀释到 3. 2pmol/ ill ( = 3. 2 ii M)。

[23]     4. 2. 2开始加样。按先加水，再加引物，最后加模板的顺序按体积从大到小将所有 样品加好（引物lul，总体积4iU)。应分别将试剂加在反应管不同方向的管壁上（水加 于下方，引物加在左边，模板加在上方）。注意要特别小心，严禁错加、漏加、多加任何其中的 一项，每加完一个项，应目测检查有无加错。因所加样品及试剂均较少，防止时间太久，导致 已加的试剂挥发，使整个反应体系失去平衡，操作时要快速准确。

[29]  2. 3加完后，盖上封口膜，4°C离心，速度到4000rpm即可。将所有液体收集到管

[12]              2. 4将96孔板的缺口置于左下角，加入liil BDT，BDT要加在管壁的左边，加完 并检查无遗漏后，盖上封口膜，离心（同3. 5. 1.7)，盖上盖子，振荡，再离心（同3. 5. 1.7)注 意最后一步离心后不要将已收集到管底的液体再次振动。

12         4.2.5放入？〇?仪中，进行扩增反应（961：2111111_;961：308,501：308,601：4111111， 25cycles;4°Cc«)。此过程约需3小时。

13         4. 2. 6PCR反应结束后离心（速度达到4000rpm即可），揭开盖子（注意勿将管底 液体振起，同时按顺序将盖子排好），加入20 ill的乙醇和NaAc的混合溶液，盖上盖子，振荡 后再低温（4°C )高速离心（4000rpm)30分钟。

14         4. 2. 7揭开盖子，盖上吸水纸，反向离心（小心速度决不能超过600rpm，严格控制 离心时间，当速度达到600rpm即停止离心）。

15         4. 2. 8向上步得到沉淀中加入冷冻（-20°C )的70%乙醇100 iil，盖上盖子，充分 振荡后，离心（4000rpm) 15分钟。

16         4. 2. 9倒去上清液，盖上吸水纸，反向离心（同4. 2. 7)。

17         4. 2. 10将洗涤好的沉淀在室温下放置10分钟左右，让残留乙醇全部挥发。

18         4. 2. 11加入20ul ddH₂0,将反应管移至3700上样底座，离心（速度达到4000rpm 即停止）抽检反应管，看是否样品溶液已经离心至管底。最后将上样底座小心放入3700仪 器的上样平台上，开动仪器电泳（3700电泳前先重启一次）。

19         4. 2. 12观察仪器运行正常后，清理好实验台，检查门窗是否关好，未使用电器的插 线板应关掉电源，确保实验室在无人时的安全。

[0076]  5.结果分析：

[〇〇77] 将测序导出的abl格式的测序文件导出后，使用Chromas软件进行分析，结果如 下：

[24]     反应1 :用于检测PRKCZ基因的rs427811位点，该PRKCZ基因的候检位点在人群 中有三种基因型：TT、TG和GG，其中携带TT基因型为正常人群，携带TG和GG基因型的人 群较携带TT基因型的人群有较高的风险罹患2型糖尿病，患病风险几率大小GG型〉TG型 >TT型，测序结果表明rs427811位点为TT型，正常；

[25]     反应2 :用于检测CAPN10基因的rs3792267位点，该CAPN10基因的候检位点在人 群中有三种基因型：AA、AG和GG，其中携带AA基因型为正常人群，携带AG和GG基因型的人 群较携带AA基因型的人群有较高的风险罹患2型糖尿病，患病风险几率大小GG型〉AG型 >AA型。测序结果表明rs3792267位点为GG型，异常。

[26]     根据上述检测结果，可以判断上述受检的PRKCZ基因正常，而CAPN10基因异常，受 检者较正常人患2型糖尿病的几率要高，但是是否已经患有2型糖尿病，还需要进行进一步 的2型糖尿病检查，并进行专门的针对性的健康管理。

[27]     综上所述，本发明的2型糖尿病相关位点检测方法设计巧妙、操作简单、检测结果 准确可靠，为是否进一步采取有针对性的健康管理以及后续的检测手段提供参考依据。

[28]     需要说明的是，在本发明中提及的所有文献在本申请中引用作为参考，就如同每 一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所 运用的技术原理，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种 改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

成都华西华科研究所研发生产多种糖尿病及并发症早期无创检测诊断系统

研发生产无创糖尿病及并发症早期检测诊断仪

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