晚期糖基化终末产物荧光光谱检测法 在糖尿病筛查中的应用研究与糖尿病早期无创检测诊断方法

摘要：主要研究人体皮肤晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products, AGE)荧光光谱的检测方法, 并对AGE荧光光谱在糖尿病检测中的应用价值进行评估。利用研制的AGE荧光光谱检测装置,分别对73例 受试者前臂内侧皮肤组织中AGE的荧光进行检测。同时，采用酶联免疫吸附法（ELISA)对受试者血清中的 AGE水平进行检测，并利用R0C曲线分别对这两种方法的检测结果进行对比分析₌结果表明，AGE荧光光谱 法检测糖尿病的最佳诊断阈值为1.919 AU，该点对应的敏感性为80. 0 %，特异性为70. 4 %。在特异性水平相 同的情况下，荧光光谱法的敏感性优于ELISA法₃ AGE荧光光谱检测法具有无创、快速&受试者更容易接受等 优点，在糖尿病筛查中具有重要的应用价值。

关键词：晚期糖基化终末产物；荧光光谱；酶联免疫吸附法；糖尿病

图丨糖尿病患者和正常人的AGE焚光光谱

1 AGE荧光光谱检测方法与装置 1.1检测方法

age是一种结构多样性的化合物，受激发后将 产生多波长的特征荧光，形成荧光带。由于糖尿病 患者体内AGE积累程度要高于止常人，激发光激励 受试者前臂内侧皮肤组织中的AGE，产生的荧光光 谱是有差别的，因此可以利用AGE荧光光谱的特异 性差异来反映受试者身体状况，这正是荧光光谱应 用于医学诊断的基础^[1<>1。

实验中，激发光照射受试者前臂内侧皮肤（受试 者测试部位需避开血管、疤痕、苔藓样硬化斑以及畸 形皮肤位置），发射的荧光通过Y型光纤传输到光谱 仪进行探测，最终由计算机显示其检测结果。

为了消除受试者皮肤差异对检测结果的影响， 提高检测的准确性，采用了峰值积分法对荧光光谱 数据进行了处理，即采用AGE荧光峰面积与受试者 皮肤反射峰面积进行比值运算，从而得到能够反映 皮肤组织中AGE水平的荧光的相对强度^[6’"^]。受试

者皮肤组织中AGE的荧光值为：

^00

i_AF(\)dX

,        J 420

^lAF ~ "390

iM)dk

j 350

〇引言

晚期糖基化终末产物（Advanced gl_y⁽'ation end products，AGE),是指在非酶条件下，蛋ft质、氨基 酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖 的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一 组稳定的终末产物^[1\研究证明，AGE不仅可以直 接影响细胞和组织功能，参与疾病的产生，也可以通 过与特异受体结合，发生反应来改变蛋白质和组织 功能，导致机体的病理性变化^[2;。AGE在正常人的 皮肤和血清中是缓慢增加的，但糖尿病患者体内持 续的高血糖环境加速了 AGE的产生，使其在患者体 内大量蓄积〜。皮肤和血清中AGE浓度的升高是 糖尿病的生物指标和对未来可能患有糖尿病并发症 的预警信号^[4]。因此，可以通过检测受试者皮肤或 血清中AGE水平来反映其身体的健康状况，为预测 或评估糖尿病及其并发症提供依据。

目前，用于检测AGE的主要方法有荧光光谱法、 酶联免疫吸附法（ELISA )、色谱分析法、免疫组织化 学法、放射免疫法、放射受体法等。其中，酶联免疫 吸附法（ELISA)具有操作简单、观察结果容易等优 点，但是此法需要制备抗体，制作过程繁琐，使其运 用受限。

AGE具有荧光交联特性，激发光谱为300- ⁴²〇 nm，焚光发射光谱为4²〇名00 因此，可以

通过检测受试者皮肤组织中AGE的荧光光谱来反映 其在皮肤组织中的含量。人体皮肤组织AGE荧光光 谱检测不需要采血化验，是一种快速无创检测方法, 现已成为"生物医学光子学"中一个重要的研究方 向。国际上，Meemaldt ^[6]等采用宽带紫外光源照射 人体皮肤，测得了皮肤组织中AGE的荧光光谱，并 将其用于II型糖尿病并发症风险的评估。Ediger ^[71等测得AGE最佳激发波长及对应的荧光光谱，并 指出无创荧光法可用于筛查糖尿病患者。在国内， 本课题组率先开展了人体皮肤组织中AGE荧光光谱 的检测及应用研究^[8'⁹¹。

本文利用研制的AGE荧光光谱检测装置，对受 试者皮肤组织中AGE的荧光光谱进行检测，并将检 测结果通过R0C曲线与ELISA法进行对比，评估 AGE荧光光谱在糖尿病检测中的应用价值。

其中，^.(A)为荧光光谱,t_R(A)为人体皮肤反 射率曲线，^ _f为皮肤组织A GE荧光值。实验中，采 用皮肤AGE荧光值来反映受试者皮肤组织中 AGE的水平。

为消除环境因素对测试结果的影响，测试时全 部在室温下进行，且对每次采集的数据都进行了暗 背景扣除。

图1为2例糖尿病患者和2例正常人的皮肤 AGE荧光光谱。可见，糖尿病患者和正常人荧光光 谱的谱型基本一致，但在整个测量光谱范围内，糖尿 病患者的荧光光谱强度明显高于正常人。

1.2检测装置

AGE荧光光谱检测装置如图2所示。该装置共 包括四个单元:激发光源、光学传输及耦合单元、信 号探测单元以及信号分析与处理单元。激发光源采 用峰值波长为370 rnn紫外LED;光学传输及耦合单 元采用Y型光纤探头，中心为一根芯径600 pm的收 集光纤，周围均匀分布12根芯径为200 pm的激发 光纤，光纤的数值孔径为0.22;信号探测单元采用光 纤光谱仪，该光谱仪采用Czerny-Turner光学平台设 计，其焦距为75 mm,探测器采用2048线性硅CCD 阵列;信号分析与处理单元是包含信号去噪处理、荧 光光谱校正、荧光信号分析及结果显示等软件的计 算机。

图2 AGE荧光光谱检测装置框图

2实验及结果分析 2. 1受试者特征参数

采用上述实验系统和方法测量了受试者皮肤组 织中AGE的荧光光谱。

采用ELISA法分别对受试者血清中AGE水平进 行检测。抽取受试者肘静脉血3 mL,温室血液自然 凝固20 min,用转数为3 000转/分离心机离心 10 min,取上清液，置于温度设为-20丈冰箱中保存 待测。检测时，使用由RB&SCIENTIAFIC公司提供 试剂盒，并按照说明进行操作。

表1为44例II型糖尿病患者和29例正常人的 特征参数，表中所列值均采用平均值±标准偏差表 示。糖尿病组44例均来源于安徽省立医院就诊的 患者，其中男27例，女17例，平均年龄59岁，所有患 者均符合2009年WHO糖尿病诊断标准，发现糖尿 病3-5年，无糖尿病并发症。正常对照组29例均来 源于该院体检者，其中男17例，女12例，平均年龄 66岁，均经确认为身体健康，无糖尿病和肾病等慢性 疾病。受试者均签署知情同意书。

表1受试者特征参数

Tab. 1 Characteristics of subjects

参数 Characteristics	糖尿病患者	正常人
	Diabetes (n = 44)	Control suhjecls (n=29)
年龄（岁） Age(years)	59 ±15	66 ± 14
性别（男/女） Sex( male/female)	27/17	17/12
血清AGE (纳克/毫升） Serum AGE (ng/mL)	300. 2 ±166.5	142. 2 ±133. 7
AGE荧光值（任意单位） Fluorescence of AGE ( AD )	2.05 ±0.24	1.91 ±0.15

2. 2荧光光谱法与ELISA法检测结果对比分析 “受试者工作特征曲线”（Receiver Operator Char­acteristic Curve, R0C ) 广泛用 于医学 诊断性 能的评 价。荧光光谱法与ELISA法的R0C曲线如图3所 示，曲线下面积分别为0.825和0.735。分析表明， AGE荧光法检测糖尿病的最佳诊断点为1.919 AU，

第1期

杨三梅等:晚期糖基化终末产物荧光光谱检测法在糖尿病筛查中的应用研究

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该点对应的敏感性和特异性分别为80. 0 %和 70.4 %。ELISA法检测糖尿病的最佳诊断点为 146.6 ng/mL,该点对应的敏感性和特异性分别为 77. 1 %和66. 7 %。当ELISA法的特异性同为

70.4 %时，其敏感性为65.7 %,明显低于AGE荧光 法的敏感性。在95 %置信区间内，采用荧光光谱法 和ELISA法检测受试者是否患有糖尿病的结果均具 有统计学意义。ROC曲线的主要参数如表2所示。

表2 ROC曲线的主要参数

Tab. 2 The main parameters of ROC curve

测tt值	诊断点	敏感性	特异性	面积	标准误差	95 %置信区间 95 % confidence interval
Test result	Threshold	Sensitivity	Specificity	Area	Standard error
AGE荧光值 Fluorescence of AGE	(A 点）1.919 AU	80.0 %	70.4 %	0.825	0.053	0.722 - 0.928
血淸AGE浓度值	(B 点）158.3 ng/mL	65.7 %	70.4 %	0.735	0.066	0.606 - 0.864
Serum AGE	(C 点）146.6 ng/mL	77. 1 %	66.7 %

1-特异性 l^_Specificity

图3 AGE荧光与血清AGE的ROC曲线

Fig. 3 ROC curve of fluorescence of AGE and serum AGE

3结论

本文利用AGE荧光特性，通过检测受试者前臂 内侧皮肤组织中AGE激发的荧光光谱，对受试者是 否患有糖尿病进行筛查，并通过R0C曲线对荧光光 谱法和ELISA法的检测结果进行对比分析。结果表 明，皮肤AGE荧光光谱可以用于评估受试者是否患 有糖尿病，且在特异性相同的情况下，荧光光谱法的 敏感性明显高于ELISA法。Nienhuis ⁿ²ⁱ等人研究表 明，较之于血浆中AGE浓度的ELISA法检测结果， 皮肤组织中AGE荧光光谱更能反映机体疾病时的状 态，此结论支持本研究结果。同时，由于其无创、快 速及受试者易于接受等优点，人体皮肤AGE荧光光

谱法将在糖尿病普查、预测和诊断中发挥重要的作 用。

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