成都华西华科研究所分析骨保护素与QCT骨密度软件体模检测

成骨细胞和破骨细胞是参与骨形态发生与骨重建的两种主要细胞。成#细胞来源于骨骼中未分化的间充质 细胞，具存#形成功能；破骨细胞是来源T血源性单核巨 噬细胞系统，具有甘吸收能力。然而，很长时间以来人们 一直注息到，破骨细胞的分化发育及其骨吸收功能，不仅 滞要骨吸收剌激因素的存在，而a萡要与成對细胞的直 接接触和相互作用才能够完成。基于此，H本学者Suda 等〜人提出一种假设，认为在成骨细胞表面存在一种因 子，这种W子在骨吸收刺激因素作用下产生，并将背吸收 信号传递给破骨细胞，使之分化发育并活化，行使骨吸收 功能。1997年，Tsiida等⑴从人肺成纤维细胞系丨MR_ 90的培养基中分离到一种分泌性糖蛋白，它可抑制分别 由1,25(01丨)₂D;、PTH和丨L- 1】剌激的3种不同伯号 传导通路所介导的体外破骨细胞形成，命名为破诉细胞 生成抑制因子（osteoclastogcnsis inhibitory factor，OCIF)。 同年，Sim_〇net^m在进行胎M小肠cDNA文痄测序时，也克 隆到了同一种分子，命名为护骨W子（Osteoprotegerin，

1.讨保护素的结构

1> OPG的基因序列经Southern杂交证实人OPG 为单拷贝基因，其序列全长29kb，包括长度分别力270、 367、192、225和1765bp的5个外显子。转录起始部位冇 3个。信号最强的在转录起始区t游的-67个核皆酸 处，命名为转录起始部位1(T1S1),较弱的两个分別在- 646(T丨S2)及-667(TIS3)个核t酸处。核苷酸保护分析 证实mRNA多从TIS1开始转录。第一个外显子编码信 号肽的10个软箪酸残某。外显子2编码OPG半胱氨酸 宮含区的的两个及第3个的73%,外显子3编码第3个 半胱氨酸甫含区的剩余部分及第4个的全部。这一点不 同于TNF受体家族其他成员，后者每个半胱贫酸宮含区 由1个外显子编码，中间由内含子分离"°。

蛋白序列中包括N端4个洧含半胱気酸的结构域 (D1-D4)和C端两个死亡域（I)5-D6)。其中D1-D4 区域成半袢状结构，TNFK - 2和CD40区则与Fas和 TNFR-1相似₀ OPG/OCIF的生物学功能依赖于D1 - D4结构的完整性，与其他TNF受体家族成员不同的是， OPG/OC1F缺乏胞浆域和跨膜域，以可溶性蛋白形式分 泌到细胞外。

2) OPG的结构OPG/OCIF域于TNF受体家族成 员，含401个氨基酸，包括一段21个氨基酸残基的信号 肽。因而成熟的OPG/O丨CF具有380个氨基酸。OPG主 要有7个区段与TNF受体家族成员蛋白构成及其相似， 但其缺乏疏水跨膜域。第1〜4个区段为半胱氨酸苗含 区，具有TNF受体家族成员细胞外部分的典型特征，此 部分在抑制破骨细胞活性方面起重要作用。第5、6区段 各含一个DDH,为唯一的一条多肽中含有两个丨)DH的 蛋白质。DDH与抑制破骨细胞形成、肝素结合或形成二 聚体无关，但其缺失可导致OPG生物活性S著下降。第 7个区段为肝家结合区域，然而〇P_G与肝素的结合在体 外实验中未发现有任何特殊意义，可能在体内具有某种 琯要生物学意义^l51。OPG可以单体或二聚体的形式存

在，第7区段为OPG形成二聚体的部位。W.S.Simonet 认为，OPG单体首先在细胞内合成，两条单体的第400个 氨基酸-半胱氨酸之间（Cys400)形成二硫键，即组成同 型二聚体。然后二聚体被分泌至胞外，亦有少里单体分 泌。怛ATomoyasu认为单体可能由二聚体裂解产生。 单体及二聚体在稳定性、特异抑制破骨细胞形成、唾液酸 贪®方面无差异。但二聚体与肝素结合及降低血钙能力 史强，故在治疗与破骨细胞形成有关的骨质疏松症方面 可能史有效¹⁶¹。

3) OPG的表达人类OPG/OCIF基因位于染色体 8923-24,具有3种〇!1^八产物，分别为2.41^，4.21^和 6.51^。其中，2.4“产物直接为（妒0/0(：吓编码，而4. 2kb和6.5kb则分别含有第2内含子的部分序列和全部 序列。

OPGmRNA广泛表达于多种组织和细胞系，在肺、心 脏、肾、肝、肖肠、脑、介髄、甲状腺、骨组织都冇表达，在骨 绀织中有较高水平的表达。在成骨细胞谱系的许多细胞 系中都可检测到其表达，包括骨髄基质细胞系、成骨细胞 系、骨肉瘤细胞系等。

2.0PG的生物学效应在体外实验中，OPG可以抑 制破骨细胞前体的成熟和分化，并抑制成熟破骨细胞的 活性。E. Tsuda^fn等发现OPG可特异地抑制1,25 (OH)₂D₃、PTH、IL- 11三种不同途径所诱导的破骨细胞 形成。1,25(0田₂1^及PTH可诱导小鼠#细胞形成破 骨细胞样细胞，但若培养体系中加人1〜4〇_ng/mL的 OPG,则破骨细胞样细胞形成受抑制。间样剂萤的OPG 亦可抑制小鼠脾细胞形成破骨样细胞。1L-11在小鼠 脾细胞及PA6细胞共同培养体系中可促使破骨样细胞 形成，而0PG则使其形成率下降。Simone^¹在鼠脾细胞 培养诱导破骨细胞形成的实验中也发现若加入重组的 OPG,则破骨细胞形成减少。体外实验发现OPG可以抑 制成熟破骨细胞在骨表面形成吸收陷窝的能力。在胎鼠 长骨组织培养体系中，OPG可抑制1，25(OH>₂D,、PGEj、 PTH、丨L-la引起的C«²♦释放Akatsu等报道⑷OPG 还可通过诱导细胞凋亡来减少破骨细胞的存活。

在体内实验中，〇PG基因敲除的小鼠，其骨密度明 显下降，小梁骨和皮质骨tt都显著滅少，生长板破坏，骨 骼强度下降，易骨折。组织学方面可见破骨细胞数目增 加，激活亢进，骨转换加速^:u>1。而过表达OPG的小鼠则 表现为严重的骨硬化，伴骨髄腔缩小导致代偿性骨髄外 造血^[31。同时，有人研究发现，正常大、小鼠，患恶性肿疱 所致的离钙血症的裸W,增加OPG含撤可迅速降低血钙 水平

3.调节OPG表达的细胞因子和药物 1，25 (OH):D₃^I,3]、TGF - 雌激素BMP - 2⑴】 PTH.丨⁸’、phorbo丨myristate acetate丨叫和 phosphate¹²⁰〕可促 进OPG衣达，而肾上腺皮质激素、PGE2和雌激索受体拮 抗剂IC118,710则下调其表达。

(二）骨保护素配基

基于OPG与TNF受体家族的同游性及其生物学特征的揭示，人们推测OPG可能通过中和一种促进破骨细 狍发育的细胞因子来抑制破骨细胞形成、激活和骨吸收。 Lace_y^l2n和Yasuda¹²²³分别在小鼠骨髓单核细胞、人淋巴 结的cDNA文库和小鼠骨髄基质来源的ST2细胞cDNA 文库中克隆到OPG的配基。该配基是一种膜结合蛋白， 厲于TNF配基家族成员，可以诱导破骨细胞样细胞形 成，但此效应可被OPG解除。骨吸收刺激因子可上调该 蛋白的表达。后进一步证实，OPGL与早先发现的可促 进丁细胞生长和树突状细胞功能的TRANCE/RANKL (TNF- related activation - inducing cytokine/receptor acti- vator of nucleic factor ^- kappa B)完全相 1.骨保护素配基的结构与功能 1) OPGL的基因序列OPGL是以跨膜或可溶性形 式存在的TNF细胞因子家族屮的一员。在离体条件下， 每当出现CSF- 1时，OPGL可连接到破骨细胞前体表 面，剌激破骨细胞前体分化形成破骨细胞。利用重组的 OPG -Fc融合蛋白作为免疫探针可用于筛选各种细胞 系和原始造血细胞表面与OPG相连接的蛋白质。通过 研究发现小鼠#髄单核细胞系32D珂表达与小鼠 - Fc和人OPG^[22_l9<1 - Fc融合蛋d相连的表 面分子。从32D细胞mRNA构建质粒cDNA表达文库， 克隆并转染到COS7细胞中，然后用人OPG¹²²^ - Fc 融合蛋白染色筛选，经证实得到一个阳性克隆，经过一系 列选择得到一个单一的质粒克降.32D-F3。用32D- F3质粒DNA再转染COS7坫养细胞，然后用人 _OPGt« -_Fc融合蛋白进行免疫反应并经结合_nTC 的次级抗体进行免疫染色。由于只有OPG-Fc融合蛋 白能接到COS7/32D-F3细胞上，因而32D-F3质粒编 码一个连接OPG的蛋白质。32D-F3克降含冇一个长 的开放读码框，在哺乳动物细胞中利用CMV后动子区 可表达得到316个氨基酸的基因产物，即OPGU含有 人opgl cDNA的质粒克隆可从淋巴结cDNA文库中分离 得到。人opgl cDNA可转译成317个氨基酸的多肽，在 OPGL中的氨基酸序列中，在49和69位氨基酸残基之 间可能含有疏水性的跨膜区域，足n型跨膜蛋白，较短的 N-末端胞内区较短，胞外区较长。C末端胞外区含有两 个部分，一个是杆状区域，从第70位亮氨酸到第157位 的U•氨酸，另一个是具有配体活性的区域，从丨58位赖氨 酸到C末瑙，该部分可能含有10个p-片呍区，它是所在 与TNF相关的蛋白质都具有的。

研究表明，用^1标记的人OPG¹²² - Fc仅连接 于用鼠opgl感染的COS7细胞上。在人293成纤维细胞 屮，用小鼠的OPG信号肽（1 -21)与OPGL的7丨-316 位残基或158-.316未成残基连接，珂产生截短了的小鼠 OPG L，其所产也的两种分泌蛋白可连接到OPG - Fc融 合蛋白上，它表明OPG既可与可溶性的OPGL,夯可与 腴连接的OPGL相互作用。经过分析，OPGL的71 -316 位残基可能编码该蛋由的胞外区。含冇158-316位的 氨基酸残基的审绀蛋白在大肠肝術中产生后，用¹²⁵丨标记 〇PGL^h58 ,暴貉于儿种形式的OPG以及与TNFR相关的两种对照蛋白质，最后经过非还原性的SDS-PAGE 电泳后被固定于尼龙膜上。结果显示出放射性标i己的 OPGL 可连接于 OPG[^22_4°丨丨-Fc 和 OPG[-Fc 融 合蛋白上。但是既不能连接于〇PG^{[22 180i}，TNFR1, ATAR上，也不能连接于蚵溶性的DRD3-Fc融合蛋白 上。各种N末端截短了的OPGL经在大肠肝菌中产生 并经纯化后，这些蛋白可通过亲和结合方式连接于固定 尼龙膜上的人OPG^:22 m -Fc融合蛋白上，分析表明垂 组的OPGL从丨26位、137位和158位残基开始均可连接 到OPG上，并且平衡解常数在1 -5nM范围内，因而这 些重组的可溶性OPGL在生物学研究中具有应用的价 值。

2)      OPGL 的结构 The structure of Osteoprotegerin Li­gand

人的OPGL为317个氨基结构的多肽，与TRAIL (TNF - related appotosis - inducing ligand, TRAIL)_N CD40、F_as等有较高的同源性。它属于U划跨膜蛋白，不 含信号狀，包括N末端胞浆域、跨膜域和C末端。除了 膜结合形式以外,OPGL还有一种可溶性形式，是在翻译 后于全氨基酸序列140或145位裂解而成，也具有牛.物 学活性。膜结合型OPGL和可溶性OPGL与OPG的亲 和力相似。小鼠的OPGL含316个氨基酸，与人OPGL 有83%〜87%的同湄性，说明在进化过程中其有高度的 保守序列^²⁴¹。

3)      OPGL 的表达 The expression of Osteoprotegerin Ligand

人类OPGL基因位于染色体13ql4,鼠则为同源的 14号染色体，其mRNA在骨骼（骨小梁和骨髄）和淋 巴组织（淋巴结、胸腺、脾和肝脏等）中表达水平最高。各 种骨髄基质细胞系、骨肉瘤细胞系、原代小鼠成骨细胞和 T淋巴细胞系都可检测到OPGLmRNA的表达。OPGL 不能在长骨的骨干和骨外膜中表达

2.OPGL的生物学效应 OPGL是目前已知的唯一 能H接剌激破骨细胞发育和使之激活的细胞因子，是破 骨细胞形成、分化、成熟并抑制其凋亡的必须因子^²"¹。 当OPGL与M-CSF合并使用时，OPGL可与破骨细胞 或其前体结合，促进破骨细胞发育，增加TRAP阳性集落 的形成。这种作用不必有其它趋钙激索或细胞因子和成 甘细胞的参与，可被OPG拮抗，提示OPGL和M-CSF 为破骨细胞形成所必需^129:。M-CSF常被称为OPGL 的允许因子另有研究证实，人外周血单核细胞在 OPGL的刺激下，能够向破骨细胞分化^:301。OPGL还有调节破骨细胞活性的作用。Lacey^lw* 发现OPGL可激活体外成熟的大鼠破骨细胞，无需M- CSF的参与，即可在牛#片上形成吸收陷窝。？11丨丨(^〜发 现OPGL可使破骨细胞运动能力增强，凋亡减少，骨吸收 增加，而OPGL的可溶性受体和OPG珂以抑制骨吸收₃ B_urge3s^lM:等应用扫描电镜发现，OPGL可使破骨细胞对 骨表面的吸收陷窝增加数倍，与成熟破骨细胞特异性结 合，诱导破骨细胞肌动蛋白环形成。由此可推断，OPGL可以直接激活成熟的破骨细胞，调节其功能。

一些体内实验也证实OPGL在破骨细胞发宵和激活 中的关键作用，在Ucey^[wl的研究中，对正常小鼠注射虽 组OPGL以剂M依赖方式迅速导致高钙血症，但OPG可 以逆转这一过程。

除了在骨和矿物质代谢方面的作用外，OPGL还可 调节T细胞和树突状细胞的生长和功能。它表达于T 细胞表面，激活树突状细胞，介导免疫应答中T细胞和树 突状细胞间的相互作用。它还通过增加抗凋亡基因bcl - xL的表达而抑制树突状细胞的闌亡◊此外，瀲活的T 细胞通过表达OPGL,与破骨细胞表曲的受体（RANK)结 合，促进破毋细胞生成。这在关节炎性骨破坏中有重要 意义&^;。Kong^[Ml等利用转基因技术进一步阐明了 OPGL的功能。他发现OPGL基因敲除小W表现奋严重 的骨硬化，生长延迟，缺乏成熟的破骨细胞。其成骨细胞 不支持破#细胞的形成，外源给予重组OPGL可改莕 OPGL基因敲除小鼠的骨质异常，促进其造血前体细胞 分化为成熟的破骨细胞，因此推断破舒细胞发育缺陷是 源于骨《基质/成骨细胞不能合成OPGL之故。与过表 达OPGL'转基因小鼠不同的是OPGL基W敲除小鼠无牙 齿萌出，具有免疫系统如B细胞、T细胞成熟和淋巴结形 成等方面的缺陷。造成这种不同的职因可能是OPGL基 因敲除小鼠在胚胎期即已无OPGL基因表达，而OPG过 表达小W的转基因在生后才被激活，故在胚胎期仍有 OPGL表达而发挥生物效应。

3.调节OPGL表达的细胞因子和药物许多趋钙 激索和细胞因子调节破骨细胞分化和功能的效应是通过 调节OPGL和OPG的相对表达而实现的。如1,25 (OH)₂D3、PGE2、PTH、lL- la、IL- lp、IL- U、TNF- «^U5]、肾上腺糖皮质激素^[361和丨L-6^:w可促进OPGL的 表达，TGF- p^[38]、降钙素^l39)、雄激索^:40]和PTH^[181抑制 其表达。另外,TGF-0可能促进OPGL的表达。在体外 实验中，TGF-p能促进0C前体细胞的移动和OPGL对 OC前体细胞的应答。

(三）RANK

1 .RANK 的结构 RANK(receptor activator of NK - •cB)是在破骨细胞和破骨细胞前体上存在的〇PGL的受 体，如同OPG，可溶性重组RANK可抑制破骨细胞的形 成和活性，RANK抗体可剌激破骨细胞的形成 RANK是TNF受体家族的成员。人的RANK是616个 氨基酸多肽，属于I沏跨眹蛋白。RANK定位于人染色 体18q22.l,它有一个28个氨基酸的信号狀，在N-末端 有184気基酸的胞外区，21个気基酸的短的跨腴区，一 个较大的383个氨基酸的C-末端胞浆区。RANK的胞 外K含有4个富半胱氨酸区和2个N-糖基化位点。它 与TNFK家族其他成员有40%的同源性^[|71。抗RANK

的抗体的Fab碎片和基因工程产生的可溶性RANK能 彻底抑制OPGL介导的OC产生¹⁴〃^5]。抗RANK细胞 外段的多克降抗体诱导了 OC产生。所以RANK对于 OPGL介导的OC产生是一个必要的信号受体。

2.RANK的生物学功能RANK是OPGL促进破骨 细胞分化的唯一靶信号受体，0PGL能特异而高亲和力 地与RANK结合。可溶性RANK则与OPG作用相似， 可阻断OPGL的促破骨细胞分化、活化功能，但OPG对 OPGL的竞争结合能力比可溶性RANK更强。RANK转 基因鼠与OPG转基因鼠表现出相同的骨硬化，正常注射 可溶性KANK也引起骨密度增高^|431。RANK受体活化 后，细胞内信号转导依赖于TNF受体连接因子（TNFR) 家族蛋白，该家族己有6个蛋白质成员（TNFR1 -6),能 激活多种信号途径，如：激活转录因子NF-*cB和丝裂原 活化蛋白激酶（MAPK),后者经激活细胞外信号调节澉 故（ERK)和c-Jim的N垵激SIUNK)可诱导转录因子c -fos和c-Jtm活性，这些级联反应均可能参与了 RANK 介导的OC分化、活化、分泌活动。另外，RANK受体可 能通过TRAF募集细胞凋亡抑制蛋白（c- IAP)而抗凋 亡，维持OC存活。转染RANK cDNA的肿痼细胞在该 受体激活后.确实观察到NF-*cB和JNK的活化。而敲 除ThA F6,c- fos和p50/52(NF- icB的两个亚中位）基 因的3种突变鼠均表现出OC分化、活化障碍和严重的 骨硬化^[461。但TRAF家族各成员蛋白对各种信号通道 的调节能力及与RANK受体的作用位点和亲和力方面 均存在差别。因此，RANK的倌号特异性取决于不同类 型细胞中珂利用信号转导因子的数量和优先结合的 TRAF种类。

虽然RANKtnRNA在多种组织中表达，RANK蛋白 的表达却仅限于淋巴细胞、活化的T、B细胞、树突状细 胞、成纤维细胞、破骨细胞及其祖细胞，说明RANK表达存在转录后调节。

(四）OPG、OPGL和RANK的作用机制全身及局部因子作为间接因子^[<7),通过3个信号途 径作用于成骨细胞，改变OFG与OPGL的比例，从而稍 确W节背的吸收。0PG与OPGL的适当平衡，是维持正 常骨代谢的基础。目前已阐明的OPG三条作用途 g^[23]:OOPG最主要的作用是与OPGL结合，拮抗 RANK与OPGL的结合，进而拮抗OPGL对破骨细胞分 化和活性的影响。②破骨细胞的细胞膜上存在一种分子 量为140KD_a的蛋白质，OPG可以与该蛋白特异结合直 接抑制破骨细胞功能。这一过程没有OPGL和RANK 参与^f<81。③通过干扰基质细胞与破骨细胞之间的相互 作用，诱导破骨细胞凋亡。这一作用主要与OPG的D5、 D6两个死亡结构同源区有关

成骨/基质细胞 破骨细胞图7-22破钟细胞的分化倌号传导过程示意阐OPG、RANK、OPGL则是最主要的调节破骨细胞分 化和功能的系统，在骨微环境中其他细胞因子可能都是 通过影响这一环路而最终起作用的。OPG浓度反映骨 代谢中年龄相关改变，骨质疏松妇女血淸OPG水平增加 代表对过最骨吸收的生理反应^|<91。而骨巨细胞瘤¹⁵⁰¹、乳 腺癌等的骨溶解破坏与OPG/OPGL比例改变有关，在骨 关节炎中吸收并活化的T细胞则通过分泌OPGL 接 调节OC的形成和成熟OC的活性，参与骨代谢^:sn。
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