成都华西华科研究所分析检测血清microRNA对糖尿病诊断潜在价值与糖尿病早期无创检测诊断方法

 摘要:微小RNA(miRNA_S)是一类小分子非编码调节其在血浆或血清的稳定存在，可作为特异的生物标志物反映机体生 理或病理变化。血清miRNAs比其他生物学标志物更为灵敏和特异，在2型糖尿病和姓娠糖床病早期诊断中具有诊断价值，可 用于糖尿病分类，评估疾病发展程度，监测治疗效果，甚至预测糖尿病的发生和早期诊断。

微小RNA (miRNAs)是近年发现的一类小分子非编码 RNA，目前在人体已发现1 048种。miRNAs在细胞核内由 RNA聚合酶II转录生成，被加工为60 ~ 110个核苷酸前体， 进人胞浆，在核酸内切酶Dicer作用下，形成长度为19 ~ 25 个核苷酸的单链miRNA,通过与特异mRNA 3'端非编码区 (3'-UTR)结合，调节基因表达^[1]。约60%人类基因受到 miRNAs调节^[2]，涉及细胞发育、代谢、细胞周期调控、细胞增 殖与分化、细胞凋亡等生理过程，也参与肿瘤、心血管疾病、 糖尿病、炎症等多种疾病的病理过程^[1]。现高度 组织特异性，病变组织miRNAs表达图谱显著不同于正常组 织,miRNAs可以更直接反映机体生理及病理状况^[3]。

许多研究证明了人体液中存在miRNAs。随着对其认识 的加深，发现疾病发生及不同病理状态下一些miRNAs的改 变可以稳定、特异地反映在体液中，尤其是血浆或血清 中^[1_5]。它们可以通过分子生物学方法进行扩增及测定，并 作为疾病早期诊断的生物学标志物^[M]。miRNAs参与胰岛 素生产、分泌以及对耙组织的作用等糖尿病的病理过程，糖 尿病患者血清也存在miRNAs的特异性改变，与健康个体有 显著差异^[8]。由于miRNAs的异常改变早于其他蛋白质表 达，在糖尿病尚未出现明显症状前,miRNAs的表达异常可能 就已出现,因此可以作为糖尿病早期诊断的新型生物学标志 物^[W°^]。对于研究糖尿病的病理、分类、早期诊断、延缓及预 防糖尿病发生具有重要意义。

1血清miRNAs作为新的诊断标志物

研究^[5’^11]表明，血浆或血清中存在miRNAs。陈曦等^[5] 比较了血浆与血细胞中的miRNAs，发现绝大多数的miRNAs 在血细胞和血浆中均存在，少数miRNAs仅存在与血浆中。 糖尿病患者血清中miRNAs的表达差异较血细胞中更为显 著,但血浆和血清miRNAs则无显著差异。这些结果提示血 浆或血清中的miRNAs并不完全来自血细胞的裂解，有少部 分miRNAs来源于血管以外。Kolfechoten等^[12]研究认为可能 是由不同的组织释放所致。Mitchell等™分析了 4种 miRNAs( miR-15b，miR-16, miR-19b, miR-24),结果表明血叛 和血清中miRNAs没有任何差异。张晓娟等^[13]对miR-16, miR-25, miR-222, miR-324-3p的研究结果与之类似。

来自患者的标本通常需要经历反复冻融等处理，因此， 作为诊断的生物学标志物应该保持稳定。血清miRNAs可在

RNA酶的降解、反复冻融、煮沸、极低或极高pH、长期储存等 某些使其他RNA降解的极端苛刻的条件下仍能保持稳 定^[4〜⁷’^11]。甚至可以用干血清或血浆进行miRNAs测定^[14]。 但某些线虫miRNAs如 cel-miR-39、cel-miR-54 和 cel-miR-23⁸ 在血浆中2 min即可降解^[11]。对于miRNAs的稳定性，目前 有多种解释，有研究^[15]表明,miRNAs在血清中形成的类似外 体样或调亡小体样结构，进人血液中的miRNAs被包裹于 50~9〇_nm膜中形成的微囊泡颗粒。其他研究表明^[16], miRNAs可与Ag_〇2蛋白形成复合物，或被高密度脂蛋白转 运，从而广泛存在于血清或血浆中。

2血清miRNAs的提取及测定

血清或血浆中^1«^₃含量极少，仅陈_等^[5]用实时荧 光逆转录聚合酶链反应（dRT-PCR)直接分析了未经提纯的 血清miRNAs,但其他文献均涉及到miRNAs提纯。方法包括 提取总RNA或提取小分子RNA。总RNA的提取通常采用 基于胍基硫氰酸-酸-氯仿的Trizol提取法，最初由 Chomczynski和 Sacchi 建立[¹⁷]。Trizol 法提取总 RNA 后，再 使用滤膜进一步纯化，能更好除去残余蛋白质^[18]。随着对 究的不断增加，建立了新的小分子RNA提取方法， 其采用不同浓度的乙醇和玻璃纤维滤膜来富集小分子RNA (<200 nt)，目前尚无研究证明该法提取效果优于Trizol法。 但是不同的RNA分离方法可以影响miRNAs分析结果，造成 结果的误差。因此，不能简单比较不同分离方法获得的 结果™。

近年来miRNAs分析技术得到了快速发展，目前文献报 道的有高通量测序技术、northen杂交、微阵列芯片及聚合酶 链反应（？〇1)等^[20]。绝大多数文献主要采用两种方法，一 是利用微阵列芯片进行miRNAs筛查，二是利用TaqMan实时 荧光定量PCR检测miRNAs。而实时荧光定量PCR法因其 敏感、特异、快速，已逐渐成为miRNAs检测的常规方法，但该 法所用试剂较为昂贵。尽管如此,miRNAs分析仍缺乏简便， 高通量的定量分析方法^[>4]。因此，要将血清miRNAs作为诊 断方法，需要建立标准且规范的提取方法和检测方法。

3血清miRNAs用于糖尿病的诊断

miRNAs不仅参与正常的胰岛素分泌，而且参与胰岛素 对靶组织作用的生理过程。最早被发现的miR-375在胰岛内含量丰富，具有调节胰岛素分泌作用[²¹]。miR-3⁷5在GK 糖尿病大鼠（一种胰岛素抵抗型2型糖尿病大鼠）的过度表 达可抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌，缺乏miR-375表达的小 鼠其胰岛P细胞总量减少^[22]。在NOD小鼠（类似人类1型 糖尿病的非肥胖小鼠）糖尿病前期胰岛炎形成期间，胰岛中 miR-21，miR-34a,miR-146水平也增加^[23]。将体外培养的胰 岛或P细胞系暴露于诱发胰岛炎的细胞因子、高浓度棕榈酸 或葡萄糖环境也导致一系列miRNAs水平的改变^[24@。

Herrem等^[27]在高血糖GK大鼠的肝脏和脂肪组织发现 miR-125a明显上调。肝脏组织miR-195和miR-103、脂肪组 织miR-222和miR-27及肌肉组织miR-10b与不同血糖水平 相关。几种miRNAs在糖尿病动物肝脏中也异常表达， miR-335在肥胖的ob/ob和db/db小鼠肝脏表达上调^[28], miR-34a和miR-22在db/db小鼠肝脏表达上调。miR-29 家族(miR-29_a,b,c)在高血糖GK大鼠脂肪组织和骨骼肌上 调^[3°^]，miR-29抑制胰岛素的作用，其在3T3-L1脂肪细胞的过 度表达显著抑制胰岛素刺激的葡萄糖吸收。在GK大鼠骨骼 肌，发现25种miRNAs表达谱改变，仅miR-130a上调^[3°^]。

机体组织的生理或病理性miRNAs改变可以反映在体液 中，特別是血浆或血清中^[1_^5]。陈曦等^[5]比较了 2型糖尿病 患者和健康对照组血清miRNAs谱，发现糖尿病患者血清 mffiNAs谱显著不同于健康对照组。提示血清miRNAs可随糖 尿病的发生而改变。作为新的生物学标志物可能应用于糖 尿病的诊断。

Zampetaki等™用微阵列系统和荧光实时RT-PCR分析 了 2型糖尿病患者血浆miRNAs，发现miR-20b, miR-21， miR-24, miR-15a, miR-126, miR-191, miR-197, miR-223, miR-320和miR486的水平低下。而孔磊等^[32]通过荧光实 时RT-PCR技术分析了 18例诊断为2型糖尿病患者、19例 糖耐量和/或空腹血糖异常的前糖尿病友19例糖耐量正常 的2型糖尿病易感个体血清miR-9, miR-29a, miR-30d, miR34a, miR-124a, miR-146a 和 miR-375,结果指出，相比于 易感个体和前糖尿病个体,2型糖尿病患者中miRNAs水平显 著升高，其中miR-34a差异显著;而易感个体与前糖尿病个 体相比，血清miRNAs没有显著差异。孔磊等^[33]研究还发现， 外周血miR-34_a在2型糖尿病发病过程中具有重要意义，但 在2型糖尿病前期阶段尚未发生明显改变。

2₁»1_{^_£11^等^[3|]研究也特别强调了血浆miRNAs作为生 物学标志物在糖尿病早期诊断中的应用。其分析了 800多 例糖尿病患者血浆miRNAs水平，其中80例为2型糖尿病,19 例研究期血糖正常但随后十年发展成2型糖尿病。在进行 年龄、性别对比分析后,发现糖尿病患者血浆13种 常，其中 miR-15a,miR-29b，miR-126和 miR-223 的水平降低， miR-28-3p的水平升高，在糖尿病有明显症状前已发生了改 变。该5种miRNAs水平分析足以鉴定70%的2型糖尿病， 而未被检出的30%糖尿病患者中或有低的空腹血糖或是血 糖控制良好。有趣的是,52%血糖正常但随后十年发展成糖 尿病的个体在研究中被归人糖尿病组。特别是miR-126，在 非糖尿病患者血清中降低被认为是显著的2型糖尿病诊断 标志，在正常糖耐量、糖耐量异常至糖尿病的进程中，血清 miR-l²6逐渐降低,miR-15a，miR-29b和miR-223显示相同的 变化特点。这些结果提示了独特的血清miRNAs分析有助于

2型糖尿病的早期诊断。

在妊娠糖尿病中也显示了 miRNAs的糖尿病诊断潜能。 根据美国妇产科学会和美国糖尿病协会的建议，基于血清的 妊娠糖尿病检查开始于妊娠24 ~ 28周，这限制了妊娠糖尿 病的干预和管理。Zhao等^[34]用TaqMan低密度阵列系统和 荧光实时RT-PCR分析妊娠16 ~ 19周孕妇血清miRNAs,在 25 ~28周以经典的方法确定妊娠糖尿病，使用Logistic回归 估计miRNAs水平和妊娠糖尿病风险，确认miR-29a，miR-132 和miR-222是有效的预测标志物，可以作为早、中期妊娠糖 尿病预测的生物学标志物。

以上研究仅仅在2型糖尿病和妊娠糖尿病中进行，要使 miRNAs成为糖尿病有效的诊断方法用于糖尿病分类，评估 疾病发展程度，监测治疗效果，预测糖尿病的发生和早期诊 断显然还需进行更多研究。

3展望

糖尿病状态下胰岛素产生细胞和胰岛素靶组织发生的 病理性miRNAs改变，可特异、稳定、敏感地反映在血清或血 浆，甚至在糖尿病尚未出现明显症状前，血清或血浆miRNAs 的异常图谱可能就已出现。血清或血浆提取的miRNAs经分 子生物学分析，表明其在2型糖尿病和妊娠糖尿病早期诊断 中具有重要的应用价值。提示血清或血浆miRNAs分析有望 作为特异的生物学标志物用于糖尿病分类，评估疾病发展程 度，监测治疗效果，对预测糖尿病的发生和早期诊断具有潜 在价值。

     成都华西华科研究所研发生产多种糖尿病及并发症早期无创检测诊断系统

网址:http:// www.qctqct.cn 

手机 : 13072875151 13398187118传真 :028-65830598

市场部电话 :028-65830598 028-67708638  83190122

在线 QQ:110480527 联系人 : 王先生

邮箱:samwangcn@126.com

地址 : 成都市静康路536号