成都华西华科研究所研发生产定量CT QCT骨密度体模软件分析系统成骨细胞增殖分化的调控机制与QCT骨密度体模软件检测方法

在成背细胞分化过程中，体内许多激素和细胞因子 通过内分泌、旁分泌和自分泌等多种途径对成骨细胞发 挥作用并影响成骨细胞发展的各个阶段，调节成骨细胞 功能_e近年来.随笤遗传学和与之相关的多学科协同发 展，我们对成骨细胞调控机制有了更深人的认识，特别是 在神经调节、转录因了•控制、药物作用和新的控制基因的 发现等方面。本节将对几个主要机制进行讨论。

(一）通过神经系统调节

中枢神经系统对成骨细胞和骨形成的作用以往并无 明确认识。Ducy等2000年发现瘦素（丨eptin)缺失导致全 身#fi增加，提示瘐素抑制骨形成^:u>1。深人研究发现， 由脂肪细胞产生的瘦素可作用于下丘脑，其对成骨细胞 性骨形成的抑制作用独立于通过抑制食欲和增加能童消 耗达到体重下降的作用。脑室内It接注射瘦索亦导致骨 形成抑制和丹贵减少，进步证实中枢神经系统具有调 节骨形成的作用。但是，与上述证据相反，许多学者亦证 明瘦素可直接刺激成骨细胞增殖、成熟和细胞外基质矿 化。首先.Reseland等^[~发现人成骨细胞中存在瘦索及 其受体表达，提示瘦家巧直接作用于成背细胞。其次，在 人原代成骨细胞或骨髄基质细胞系hMS2 - 12培养中， 应用瘦衆均可促进向成骨细胞分化。我们应用骨髄细胞 厣代培养也发现瘦索抑制细胞增飱，同时促进成骨细胞转 录因子Cbfal和Cbfb的表达，提示瘦素是具有外周局部作 用的重要细胞因子^[u]。再次.瘦素基因敲除小鼠（oWob) 应用瘦素后，表现为骨t和骨密度增加，肢体增长。间样， Mmkovic等％³应用DXA骨密度仪测莆发现宵存期少女血 淸瘦素水平与骨密度M正相关。总之，瘦索对成骨细胞作 用机制及与骨形成的关系尚无定论。

交感神经系统近年来被认为参与骨形成的调节，而 且是处于瘦索调节级链的下游。Takeda等…¹发现敲除 去甲肾上腺素和肾上腺素合成必芮酶多巴胺羟化稱， 即抑制了交感神经递质后，小鼠骨fi增加，此时脑室内直 接注射瘦索不能逆转导致骨形成抑制和骨《减少。应用p受体阻滞剂心得安亦可造成#世增加。

中枢神经系统渊节的另一证据是大脑内Y2神经肽 (NPY)受体失活后，小鼠表现为饵M增加，而脑室内注射 NPY导致骨形成抑制，提示NPY的中枢作用是通过其 与受体结合完成的^[NPY与瘦索可能是通过分别路 径发挥作用，而且Y2受体亦被证实参与调节交感神经 活性，此方面研究正在继续进行中。

(二）激素和细胞因子调节

体内和体外研究都证实多种系统激素和细胞因子对 成骨细胞原型的诱导分化和成骨作用产生影响，包括甲 状旁腺激素及相关肽（PTH/ PTHrP)、l，25-二羟维生 索D3 [1，25(0丨丨)₂D₃]、降钙素（CT)、糖皮质激素、生长 激索、甲状腺激素、性激素等。除以上局部因子外，其他 因子如表皮生长因子（EGF)、TGFa、血小板源性生长因 子（PDGF>及一氧化氮等均对骨形成有明显作用。

1.      糖皮质激素地塞米松（dexamet.hasone，Dex)作 为合成的可溶性糖皮庾激素是体外诱导成骨细胞生长和 分化的束要因子。Dex是绝大部分种属骨髄基质细胞向 成骨细胞分化过程中所必笛的，其基本作用是在转录水 甲促进各种成熟成骨细胞标志物的表达，促进ALP活 性，并促进骨结节的形成。另外，Dex增强cAMP对 PTH、PGE1和毛候索（forskolin)的应答。研究表明 Dex在细胞增殖后期M著提高OPN和ALP水平（10 -30 倍），这一改变有助于增加细胞外基质羟磷灰石结晶沉 淀，加快骨化过程。同样，Dex可提商0CN水平50〜100 倍，进一步说明Dex对成骨细胞功能的促进作用。

佴是，体外实验显示，经多次传代的成熟成骨细胞对 Dex剌激细胞增生和细胞外基质矿化作用无反应。这一 方面说明Dex加速厣始未成熟细胞的分化，另一方面也 大大减少了前体细胞池内细胞最，这一现象与体内观察 Dex作用相符。体内长期应用糖皮质激素后，表现为血 淸OCN水平下降，骨M丢失，反映了在大1消耗#髄池 中未分化细胞后，成熟成#细胞功能减弱，饵形成与骨破 坏平衡失调。

2.      雌激素雌激索在维持骨代谢平衡中发挥着重 要作用。成骨细胞中雌激素受体的发现，提示雌瀲索对 成骨细胞有着直接的阔控作用^117]。在应用各种体外细 胞培养体系，包括原代头盖骨或骨膜内细胞培养、不同来 源的成骨细胞系、水生态细胞和成熟成骨细胞等研究雌 激素作用时发现，雌激素对成骨细胞増飱和分化可以产 生多种不同甚至相反的作用。雌激索被发现可以促进或 抑制成骨细胞增殖，促进或抑制多种成钟细胞成熟标忐 物如COL- 1、ALP和OCN的表达，亦可以对两者均无 作用^[~。多种厣因可能导致上述结果的产生，其中包括 用于研究的成钟细胞来源于不同的动物种系，细胞雌激 索受体水平不同，细胞体系内增生或分化不同步、或同源 性差，等等。B前多数学者认为，所应用的体外成骨细胞 培养体系是否模拟生理状态下细朐对雌激索的反应，在 很大程度t决定了所发现雌激索作用结果的真实性和代 表性。

长期以来骨髄内被认为含有可向前成骨细胞分化的 基质干细胞^||91。应用骨髓基质干细胞诱导分化的成骨 细胞作为模增进行观察，可能更接近体内微环境，符合成 骨细胞由增殖到分化成熟的发育过程。在这样的体系 中，雌激素明显地刺激成#细胞增殖，在mRNA和蛋白 水平促进成骨细胞特异性ALP、COL-丨和OCN等表 达，同时，细胞外基质钙沉积和骨样小结形成增加。雌激 素在此体系中的作用被认为是通过其与受体结合完成 的，因为雌激素受体（稳定表达于整个细胞分化过程，并 且所观察的雌激索刺激作用可被雌激素受体拮抗剂ICI 182,780 阻断:²°^】。

3.维生索D 活性维生素D, 1,25-二羟维生素 D3[l,25(OH)₂LU，是体内调节钙代谢的主要激索。体 内和体外实验均证实，l,25(OH)₂D3可作用于成种细胞 并影响其功能，而且，此作用具有很强的时相选择性

在细胞增琯期，l,25(OH)₂D₃作用表现为抑制成骨 细胞成熟。体外培养细胞无多层状结构形成，无细胞外 基质蓄积，主要成贵细胞标志物如COL- 1和ALP被下 调。由于ALP活性升高是启动细胞外基质矿化的关键 因素.因此，在l,25(OH)₂D₃作用下，细胞外基质矿化停 滞。与此相反，当l,25(OH)₂D₃作用于成熟成骨细胞 时，几乎所冇成骨细胞标志物，包括COL - 1、ALP、 OPN和0CN等均可被上渊。而R,原位杂交实验表明， l，25(OH)₂D，作用集中表现于可形成骨小结的成骨细 胞，这些细胞舒展、加长并发生极化，OCN表达呈数倍增 长。这些形态和基因表达上的变化一方而说明成骨细胞 成熟加快，另一方面，也为成骨细胞调节破骨细胞骨吸收 作准备。

由于各种成骨细胞标志物基因中尚未发现 1,25(0^4)₂认反应元件、结合因子或其它相互作用序列， 目前对l,25(OH)₂D₃双时相作用机制仍未阐明。对与 l,25(OH>₂D，反应元件（VDRE)可能的交互作用机制，如 蛋白-DNA或蛋白-蛋白结合后产生调节等，仍有待于 在转录或转录后水平进一步发现^:401。

4•转化生长因子pi转化生长因子pi (transform­ing growth factor- pi , TGF01)是促进多种细胞生长和分 化的主要细胞因子。体内实验证实，成骨细胞合成并分 泌TGFp丨，局部注射TGFpl可以促进骨形成但是， 在鸡骨膜内细胞和新生大鼠头盖骨来源细胞培养中， TGF卩1抑制成骨细胞原型产生，此抑制作用呈剂®依赖 性^[231〇 TGFpl体内和体外作用不同的可能解释是：①体 内存在除成骨细胞外广泛的TGFpi靶细胞，在TGFpl 作用F可产生多种细胞因子协同作用，而体外细胞培养 中细胞种类单一，而且培奍条件与体内环境有差异；②体 外培养中TGFplmRNA的高峰水平出现于细胞增殖期， 在增殖后期水平下调，因此,TGFP〗抑制成骨细胞分化作 用集中表现在抑制细胞的增殖。

进一步研究发现，TCFpi体外对成付细胞作用呈双 相性。在细胞培养早期短哲给予TGFpl导致细胞形态 停滞于成熟P期，骨小结形成较少，细胞外基质不发生矿化，与细胞成熟相对应的ALP及OCN的mKNA和蛋d 表达均下调。但是，持续应用TGFpl及在细胞增殖后期 或传代培养中加入TGF卩1时，成骨细胞分化并不受抑 制，显承TGFP丨在细胞增殖期作用可被逆转。Harris等 报告TGFP1在新生大鼠头盖骨来源细胞培养中下渊 BMP-2表达，提示BMP亦参与TGFpi调节作用^:〜。

5. #形态蛋白系列骨形态蛋白（bone morphogenic proteins, BMPs〉属于TGF(B超家族，其主要生物学作用 是诱导未分化的间质细胞分化，促进软骨和新生#形 成^¹。！^!^?-?诱导前成#细胞分化为成骨细胞。在 MC3T3-E1小鼠成丹样细胞培养中，增加COL_ 1合 成，提高ALP活性，但对细胞增殖无影响。BMP-7抑制 ROS17/2.8大鼠骨肉熵细胞增殖，但在人成骨细胞培养 中.BMP-7刺激细胞增殖。

BMPs是成骨细胞分化和骨形成过程中的一个重要 促进因子_〇糖皮质激索、丁〇?0和％11*)坷促进81^^-2、 BMP- 4、BMP - 6对成骨细胞分化的诱导作用，其中 BMP-6介导糖皮质激素诱导的成#细胞分化的作用。 BMPs对其他生长因子亦产生影响，BMP-2刺激大鼠成 骨细胞产生IGF- I和丨GF- II，BMP-4促进TGF0水 平升高，而BMP-7可增加丨GF- D受体的数里，同时促 进胰岛素样生长因子结合蛋白丨GFBP-3、-5的产生。

(三）转录因子

目前为止，在核酸转录水平上我们对成#细胞的形 成乃至骨形成的机制与调控因素所知甚少。成骨细胞来 源于中胚层基质细胞，成年后背髓中多功能干细胞或骨 始祖细胞（osteoprogenitor)是成#细胞的重要储备，在适 当剌激条件下可分化成为成熟成骨细胞。发育遗传 学研究表明，多种转录因子在成骨细胞分化和骨形成过 程中发挥作用，包括直接控制成骨细胞分化的控制因子 和与其协间或竞争抑制的若干因子。

生物进化中卨度保守的细胞核内转录因子，核心结 合因子 al(core- binding factor al, cbfal )，是成骨细胞分 化和骨形成过程中的控制因子％^]。敲除此基W导致成 骨细胞缺失，骨和软骨发育不良或终止。Cbfal杂合子小 鼠表现力膜内成骨缺陷，人类cbfal突变则表现为头颅锁 骨发育不良。另外,cbfal促进成骨细胞标志物如丨型胶 职蛋白和#钙索的表达。这一切均提示cbfal在成骨细 胞的分化和成熟过程中不但起若关键作用，而且是必需 基因参与cbfal作用的因子目前发现有AJ18和 Cbfp¹², ²*¹。/VJ18与cbfal的DNA结合序列竞争性结合， 从而抑制cbfal活性。核心结合因子p(corc-binding fac- tor-p, Cbfp)则与cbfal形成异源二聚体，促进cbfal的 DNA结合和转录功能。

Osu^ixmSX)是含有锌指结构的转录因子。小鼠敲 除OSX后，动物M表现为软骨发育正常，但垃成骨细胞 及骨苺质矿化缺失，显示出与cbfal敲除后不同的表型， 提示OSX在成骨细胞分化中的特殊作用。深入研究发 现,cbfal敲除小鼠不表达OSX,而OSX敲除动物cbfal 表达正常。同时,OSX敲除动物的成骨细胞前体细胞中表达软骨细胞标志物，如Sox9和Col2al,提示OSX是作 用于cbfal下游的成骨细胞靶向促迸因子^[291。

同源结构域蛋白 Dlx (distal - less homeobox)和 Msx (msh homeobox homologue)是表达于成骨细胞分化早期 的转读因子，其作用具有转录激活和抑制双向性。人和 小鼠的突变实验证实Dlx5和Msx2是正常膜内化骨所必 需的^[w3。Dlx5/DU6是诱导脊推动物椎骨和附骨的调节 因子，Msx-2基因自然缺陷与颅骨和颅面异常畚关。

原癌基因编码的蛋白参与细胞生长调控，其中fos/ jim家族转录因子是骨细胞活性发展和维持的1[要介 质^:31]。c-fos和c- jun形成二聚体与DNA的AP- 1位 点结合。研究发现体内c-fos多表达于生长潜能最大的 胎骨区域，提示c-fos可能在成骨细胞分化中发挥作用。 转基因小鼠c_fos失表达或c-fos过表达都导致显著的 骨异常，分别表现为骨硬化病和骨肉痛。这些结果提示 fos/jmi家族表达的严格调控对正常的骨发生十分重要。

(四）骨形成相关新基因

近年来基因突变研究发现，两种新基因对提高机体 骨里有审要影响，而且，此作用具有骨组织特异性，在突 变条件下机体其他器官形态功能不发生变化。这两种基 因分别是腊蛋白受体相关蛋白-5(丨丨}^1^>〇16丨1^6€601〇1^>- related protein 5，LRP5)和 Sclerostin (SOST)基因。

遗传学家族调査研究中发现，LRP5编码基因位于第 11号染色体长臂（llql3>,当G171V位点突变时，机体表 现为M著的骨攮升麻^[32]。与此同时，LRP5基因也被发 现是骨质疏松-假神经胶质痛综合征（osteoporosis- pseudoglioma syndrome ， OPPG) 的突变 位点。 OPPG 是 — 种常染色体隐性遗传病，其特征是骨形成减少导致的骨 质疏松和原发性玻璃体血符变性引起的假神经胶质瘤。 因此，遗传学证据昆示LRP5特殊位点显性突变时，骨形 成增强，骨里升高；而LRP5缺失时，由于骨形成减少而 导致骨质疏松。

动物实验中也证实了 _t述发现^[M]。敲除LRP5小鼠 由于成骨细胞增殖下降，出生后发生骨墩丢失。相反，在 G171V突变转基因小鼠中，骨形成增强，骨置增加。在这 些小鼠中，骨S增加并未引起其他发痒障碍，提示LRP5 作用具有#组织特异性。

LRP5的作用机制近年来也被初步闲明LRP5 属于LDL受体超家族，它与此家族另一成员丨上P6在结 构上商度同源。体外实验证实LRP5与LRP6同样，参与 决定体内许多发育过程的Wingless/Wm信号传导系统。 LRP5铨先与Wm家族的Wml和Wm3a结合，然后共 同与细胞膜Wms受体Frizz丨ed形成复合体，介导经典的 Wnt信号传输。研究表明Wm3a激活后沿此信号途径成 骨细胞分化增强。当Dickkopf - l(I)KK)与Wnt竞争性 结合并消粍LRP5后，阻断了上述信号系统，#形成被抑 制。而LRP5点突变后，有可能更易与Wm结合，从而强 化Wru信号系统，使骨形成增强。总之，Wingless/Wnt信 号系统已被认为与四肢及软骨形成有关，但其对骨特别 是成骨细胞的选择性作用机制尚冇待于进一步研究。

化，与细胞成熟相对应的ALP及OCN的mKNA和蛋d 表达均下调。但是，持续应用TGFpl及在细胞增殖后期 或传代培养中加入TGF卩1时，成骨细胞分化并不受抑 制，显承TGFP丨在细胞增殖期作用可被逆转。Harris等 报告TGFP1在新生大鼠头盖骨来源细胞培养中下渊 BMP-2表达，提示BMP亦参与TGFpi调节作用^:〜。

5. #形态蛋白系列骨形态蛋白（bone morphogenic proteins, BMPs〉属于TGF(B超家族，其主要生物学作用 是诱导未分化的间质细胞分化，促进软骨和新生#形 成^¹。！^!^?-?诱导前成#细胞分化为成骨细胞。在 MC3T3-E1小鼠成丹样细胞培养中，增加COL_ 1合 成，提高ALP活性，但对细胞增殖无影响。BMP-7抑制 ROS17/2.8大鼠骨肉熵细胞增殖，但在人成骨细胞培养 中.BMP-7刺激细胞增殖。

BMPs是成骨细胞分化和骨形成过程中的一个重要 促进因子_〇糖皮质激索、丁〇?0和％11*)坷促进81^^-2、 BMP- 4、BMP - 6对成骨细胞分化的诱导作用，其中 BMP-6介导糖皮质激素诱导的成#细胞分化的作用。 BMPs对其他生长因子亦产生影响，BMP-2刺激大鼠成 骨细胞产生IGF- I和丨GF- II，BMP-4促进TGF0水 平升高，而BMP-7可增加丨GF- D受体的数里，同时促 进胰岛素样生长因子结合蛋白丨GFBP-3、-5的产生。

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