成都华西华科研究所研发生产定量CT QCT骨密度体模软件分析系统成骨细胞标志物与QCT骨密度体模软件检测方法

在蛋白和分子水平，体内通过免疫和厣付杂交研究 发现成熟成骨细胞合成并分泌多种蛋白，包括与细胞膜 相连接的碱性磷酸酶，讶基质蛋白如I甩胶原蛋臼、骨钙 素、背涎蛋白、毋桥素及激素和多种生长因子受体等。虽 然这些蛋白不只特异地由成骨细胞合成，但是，不同时期 的成骨细胞可能仅产生部分上述蛋白或因子，向且随者 这些蛋白的产生成骨细胞分化进人了不同阶段，伴随着 细胞外棊质也不断成熟，因此，上述蛋白的合成和分泌成 为成骨细胞的重要标志。

(一）碱性磷酸酶

人体内主要存在骨、肝、肾碱性磷酸醃（alkaHne phos­phatase, ALP) 同工酶，它们由同一种基因编码，只足转录 后侧链的糖基修饰不同。ALP属于细胞膜表曲蛋内，与 辑脂味肌醉（phosphatidylinositol，EM >形成复合物，可在 PI特异性磷脂酶作用下释放。现已发现，成骨细胞特异 性AI-P活性增强时，细胞央趋f d分化状态，饵形成亦 增强。ALP的确切生理功能尚不淸楚。研究表明ALP 参与细胞外基质矿化过程，抑制ALP活性在体内和体外 均导致#矿化+良。用左旋咪唑抑制碱性磷酸酶活性能 阻断体外骨蓽质矿化；遗传性碱性磷酸酶缺陷的低磷酸 梅症患者#矿化差；骨、肝、肾碱性磷酸酶基W变异，解活 性缺失，亦导致肢体骨骼低矿化₃另外，ALP还被证实参 与调节成竹细胞迁移及粘附。佴是，敲除ALP.基因后并 未发现胚胎发育和骨形成异常，提示ALP并非必笛，或 尚有其他同丁.酶可发挥代偿作用

(二）         I型胶原蛋白

I型胶原蛋白（collagen type I，COL - 1)是由成骨细 胞分泌的主要细胞外基质蛋白，约占成骨细胞分泌蛋白 总世的20%，其作为背基®形成中成背细胞琅早的产 物，是成骨细胞表型的特征性标志。应用原位杂交和免 疫标记方法均显示成熟成骨细胞呈COL- 1强阳性染 色，前成骨细胞和骨细胞亦有部分染色。COL-丨占成熟 骨组织有机成分的90%,经成竹细狍合成分泌后，在细 胞外基质形成网状结构，是钙盐沉积和矿化的基础。

(三）         其他非肢原蛋白

在成骨细胞分泌的非胶职蛋白中，骨钙蛋白（osteo­calcin， 0CN) 被认为是最晚期表达的标志物。 OCN 不表 达于前成骨细胞，而仅大甩表达于成熟成骨细胞。骨桥 蛋白（osteopontin, OPN)与骨诞蛋白（bone sialoprotein， BSP)在结构上有许多相同之处。OPNJ& —种分泌型磷 酸糖蛋白，由成伢细胞合成，分泌到细胞外基质。OPN 不仅产牛于骨组织，多种非骨组织细胞在体外受到增殖 剌激或促肿瘤因子及生长因子诱导时都能表达骨桥蛋 白。大多数研究表明OPN在前成骨细胞开始表达，在成 骨细胞表达达高峰。H前报道合成BSP的唯一的非骨细 胞是胎盘滋养层细胞。与OPN相反，BSP具有非常严格 的组织分布，仅产生于与骨相关的细胞，如成骨细胞、肥 大的软骨细胞和骨细胞等。BSP亦不表达于前成骨细 胞。成骨细胞还产生和分泌多种基质蛋白，包括骨连接 带白（osteonectin)、纤维连接资白（fibroneclin)、BAG - 75、 双糖链蛋白聚糖（biglycan)、核心蛋白聚糖（decorin)、 CD44等，这些蛋白亦见于其他组织中，但这也从另一方 面显示了成骨细胞具有强大的蛋白分泌功能。

成骨细胞同时还合成和分泌多种生长因子及其受 体，包括骨形态蛋白家族（BMPs),转化生长因子 p(TGFp),胰岛素样生长因子（lGFs>，血小板源忭生长因 子（PDGFs)碱性纤维生长因子（bFGF)等。这些生物活 性物质都存在于骨基质中，对骨代谢发挥多种作用。有 报道丨GF-丨型受体表达于成骨细胞，在骨细胞中表达消 失而表皮生长因子（EGF)仅与前成骨细胞结合，表 明其受体表达于未完全分化细胞PTH/PTHrP•受体 的表达阶段尚有争议，但H前多认为其多衣达于分化晚 期的成骨细胞，很少表达于前成骨细胞，在骨细胞和队形 细胞中则未见表达〜。在成种细胞忐面还发现雌激素受 体和丨，25-羟基维生素D受体。

(四）         单克隆抗体

应用单克降抗体特异地识别各分化阶段的成骨细胞 是研究成骨细胞分化和功能的一个重要方面。尽管H前 已发现一些抗体可以分别识别细胞表面、胞浆内和细胞 外基质中的抗原决定部位，但是，极少抗体可以识別前成 骨细胞或谱系中更原始的细胞群。现已发现的可以识别 早期细胞的单克隆抗体包括：①由杂交瘤细胞系产生的 抗体SH-2、SH-3和SH-4可以识别骨髓基质细胞，而 在成熟成骨细胞和骨细胞中无结合，提示这三种抗体的抗原决定部位可能存在于早期未分化细胞中，随若细胞 的逐渐成熟而消失^m;©STR〇-l可以识别人骨髄基质 中具有集落形成潜能的细胞，STRO- 1阳性细胞经传代 培养可继续向成熟成骨细胞分化③SB-5可以识别 鸡骨细胞，在与其他单克降抗体如SB- K-2、_ 3联合 ^用时，可以帮助识別鸡成枵细胞分化的不R阶段^[9)。 亦有若干其他抗体正在研究阶段，希望通过更多新抗体 的^生,II够更加细致的确认成骨细胞转变和成熟的各 个阶段。

四、成骨细胞分化和分子生物学特征（Osteo­blast differentiation and features of molecular bi­ology)

在过去几十年里，随宥哺乳动物原代培养方法及多 种细胞系的達立，骨生物学领域取得了长足的进展。多 种来猓的体外培养细胞可以在特定条件下模拟成骨细胞 体内分化过程，从而使成骨细胞各发展阶段棊因表达规 律的可被系统地观察和研究_s

结合应用DNA印迹分析、原位杂交技术和核转录分 析等方法，人们在头盖骨分离细胞和骨髄细胞培养中都 发现，在成骨细胞分化进展过稈中存在若细胞生长和组 织特异性基因的序贾表达。由此，成骨细胞分化可被分 为四个发展阶段，即成骨细胞增殖，细胞外棊质成熟，细 胞外基质矿化和成骨细胞凋亡阶段。首先，成骨细胞增 殖阶段成骨细胞数坩增加，形成多层细胞，并向细胞外基 质分泌I型胶原蛋内（COL-丨）。在此阶段，与增飱激活 有关的基因如c- myc、c^- 〖os、c-〗un和与细胞周期有关 的基因如组蛋白、细胞周期蛋白充分表达，同时多种生长 因子如纤维生长因子（FGF)、胰岛索样生长因子（IGF)、 转化生长因子P( TGF幻、纤维连接素（fibronectin)等基因 也充分表达参与调节细胞外基质合成。在细胞增殖晚 期，参与细胞外基质成熟的蛋白的基因开始表达和上调， 主要表现为碱性磷酸酶（ALP)表达升高，同时，COL - 1 继续合成并相互交联、成熟，为细胞外基质矿化做准备， 此阶段为细胞外萆质成熟和m组阶段。在细胞外基质矿 化阶段，ALP表达下降，而与细胞外矿物质结合相关的蛋 白基W表达达到高峰，如OPN、OCN、BSP等，提示这些 蛋d的表达和分泌与细胞外基质中羟磷灰石沉积及骨样 结构的产生和调节密切相关。在细胞分化成熟最后阶 段，胶职蛋内醣开始出现和增加，成骨细胞出现凋亡，细 胞代偿性增殖并同时有COL-〗的合成。

值得注意的垃，在体外成骨细胞分化过程中有两个 重要转折点。第一个转折点发生在成骨细胞增飱结束， 各种细胞周期和生长相关基因下调，编码细胞外基质成 熟的蛋白苺因开始衣达和上调时。研究表明，当c -fcs、 c-jim等与成骨细胞成熟期分泌蛋白基因的调节元件结 合时，抑制这些蛋白的表达。但是，与细胞外苺质成熟阶 段基因表达直接关联的还足成骨细胞分化程度，而非细 胞增殖的减缓。第二个转折点是当细胞外基质开始矿化 时。细胞外基质是否矿化决定了成骨细胞成熟后期多种

基因的表达，OPN和OCN都尨随着细胞外基质矿化开 始表达，此时ALP表达水平开始下降，而COL- 1和骨 连接蛋白等的表达则不受影响。实验证实，源自细胞外 基质的某些信号对于成骨细胞增殖和分化有着电要的调 控作用。当在细胞培养中加入不同浓度的维生素C时， C0L-1合成增加，ALP mRNA水平和酶活性均升高，成 骨细胞增殖停止。当细胞培养于COL-1凝胶上时，成 骨细胞分化加速，表现为ALP和OCN的提前表达。

总之，对成骨细胞增殖和分化过程中多种基因启动 和表达程度变化的深人研究将有助于我们发现和认识各 种可能的调节机制，同时，也有助于在细胞和分子水平建 立评价骨代谢和转换的指标，为指导彩响骨代谢的药物 研发及临床骨病观察提供理论基础。成都华西华科研究所研发生产QCT定量CT骨密度体模软件分析系统  
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