成都华西华科研究所分析环磷酰胺致骨质疏松动物模型与QCT骨密度软件体模检测

环磷酰胺致骨质疏松动物模型（Osteopo­rosis induced by cyclophsphamid treatment)

基本原理：环磷酰胺（Cydophsphamid)是一种烷化 剂，由于其具有明显的抗癌和免疫抑制作用，临床广泛用 于各种肿瘤和变态反应性疾病。文献报道某些肿瘤病人 在使用环磷酰胺等化疗药后引起迅速骨丢失；我们发现 环磷酰胺4.5mg/kg可致大鼠产生骨质疏松，环磷酰胺 20mg/kg可致小鉍产生骨瘐疏松，环磷酰胺致骨质疏松 可能与其免疫抑制作用，促进骨钙释放，抑制骨羟脯氨酸 的合成及骨钙的沉积有关，环磷酰胺造成动物骨质疏松 模型具有骨矿物质和骨基质等比例的减少的特点，可用 于研究各种抗骨质疏松药物的作用和作用机理^[M-^>71。

(一）环磷酰胺致大鼠骨质疏松动物模型

操作步骤：3月龄雄性Sprague - Dawley (SD)大软 随机分为4组：Am:正常对照组；L组：环磷酰胺低剂里 绀；M组：环磷酰胺中剂M组；H组：环磷酰胺高剂簠组。 每组8只。正常对照A组每天灌宵给予生理盐水丨〇_m|/ kg;环磷酰胺L组每天灌宵给予环磷酰胺丨.5mg/kg;环 磷酰胺M组每天灌宵给予环磷酰胺4.5mg/kg_;环磷酰胺H组每天灌肖给予环磷酰胺13.5 mg/kg。四组动物均自 由饮水和进食标准饲料。于实验第15天处死动物，取取 血，组织器官和骨标本做测定。研究表明不同剂里的环 磷酰胺对大鼠体重，血白细胞，重要的免疫器官等有量效 关系，随着环磡酰胺的剂量增加而药理作用增强，免疫抑 制作用增大，毒性也增加。对#代谢的影响规察，高、中、 低=种剂世的环磷酰胺均可使大鼠骨钙总量减少和骨钙 /骨干電比值明显降低，提示了对骨羟脯氨酸的观察发现 低剂量的环磷酰胺可使骨羟脯氨酸含*增高，中剂谩的 环磷酰胺可使骨羟脯氨酸含贵降低，而离剂量环磷酰胺 对骨羟脯氨酸没有明显影响。骨形态计置学观察，高中 剂撒的环磷酰胺可使大鼠股骨远端松质骨骨形态计量学 静态参数明显改变，说明该剂量环磷酰胺可影响骨的形 态及结构.使其骨小梁面积、数虽减少，骨小梁之间的分 离度增加，骨质变得更加疏松。另外，从骨组织形态计量 学动态参数方面，高中剂》的环磷酰胺可使骨小梁荧光 标志周长百分数、矿化沉积率、骨小梁周长形成率、骨小 梁面积形成率、骨小梁体积形成率均减少。但对破骨细 胞数量、破#细胞周长百分率及破骨细胞吸收表面周长 百分率没有作用。这些结果提示了坏磷酰胺致骨庾疏松 的作用部位是成骨细胞。环磷酰胺能引起以骨形成减少 为特征的骨最变化，充分考虑用药剂激及用药时间因索， 可以用于建立大賊#质疏松动物模型

(二）环磷酰胺致小鼠骨质疏松动物模型

操作步骤：昆明种小鼠，体重（20〜22g),雌雄各半。 随机分组。A组：正常对照组，每天灌肖给予生理盐水 10mg/kg_; B组：环磷酰胺模型组，每大灌肖给予环磷酰胺 20mg/kg。每组10只。各组动物均自由饮水和进食标准 饷料。于实验第15天处死动物，取胸腺、肝、脾和右側股 骨供测定用。结果，环磷酰胺可使小鼠骨钙及骨羟腩氨 酸含最等比例减少和胸腺萎缩。骨矿物质和骨基质等比 例的减少是佴质疏松的特征，环磷酰胺致骨质琉松的表 现在人类抗肿梱的研究中已有文献报道，该药可使某些 肿瘤病人在使用药后引起迅速骨丢失。本实验结果表 明，环磷酰胺可使骨羟脯氨酸的含M明显降低，而骨羟脯 氨酸娃肯胶原的审.要组成成分，主要由成骨细胞合成与 分泌，是骨合成的一个重要环节。因此环磷酰胺使骨胶 原减少，说明了其可能对成骨细胞产生抑制作用，使其合 成和分泌胶原减少。骨的合成过程是先有骨基质的分 泌，再促使钙质的沉积。环磷酰胺使骨胶原减少可进一 步导致骨钙沉积减少，并使骨贵丢失，导致骨质疏松。环 磷酰胺20mg/kg给于小鼠，仅15天可引起以伢钙及骨羟 脯氨酸含馕等比例減少为特征的背质疏松，这提示了该 动物模型可能是一个研究骨质疏松的较理想的模型【3卜則。

七、低钙饲养致骨质疏松动物模型（Osteopo­rosis induced by low calcium feed)

基本原理：钙是骨的基本成分，骨中的钙占人体全身 99% ,通过在饲料中对实验动物限制钙的供给，干扰其骨

组织的生长发合，可以造成骨质疏松性病理学的改变。 骨质疏松的饮食危险因素包括钙摄人减少，维生索D不 足，膳食中的钠、蛋白质、有机磷含憊过高等。当钙摄入 不足或钙吸收功能低下使机体缺钙时，可继发引起甲状 旁腺激索（PTH)分泌增多，使骨吸收亢进。长期缺钙将 导致骨量丢失，发生骨质疏松症大鼠在幼时钙摄人不足， 其#峰董值下降，而低骨峰童值使增龄后#质疏松发生 的风险大大增加。其次，有流行病调査报道，人群中蛋白 质摄人最与骨密度显著负相关。高蛋白摄人使尿中代谢 固定酸含撤增加.肾近曲小管钙重吸收减少，尿钙增加， 同时激发胰岛素与胰岛索生长因子对骨细胞调节作用。 蛋白质摄人大多与磷结合，同时增加磷的吸收。后者能 减少尿钙排泄，抵消高蛋白摄人引起的尿钙增加，但磷使 钙从粪便中排泄里上升，所以过多的蛋白摄人的净效应 是增加负钙平衡。有研究报道低钙，低钙联合高蛋白饲 料，或低钙联合低蛋白饲料可使大鼠发生#质疏松，补充 饮食钙或鸡蛋壳钙粉可预防大鼠骨质疏松的发生^f40~⁴²¹。

(一）   低钙饲料致大鼠骨质疏松的动物模型

操作步骤：3月龄雄性Sprague - Dawley(SD)普通级 大鼠40只，体重（280±22)g,随机分为5组。第1 ,2组 饲养1个月，分为正常对照组（Ca 1.0%)和极低钙组 VLCD(Ca0.1 %),余下3组饲养3个月，分为正常对照 组（Ca 1.0%>、极低钙组VLCD(CaO_l%)和低钙组LCD (CaO.3 %)。所有动物在同等条件下饲养，自由摄食，每 周称体取1次。全部大鼠在处死前第14、13天和第4、3 天分别给皮下注射盐酸四环索（25mg/kg>和钙黄绿素（5 mg/kg)。实验结束时，取左侧胫骨进行检测。结果，低钙 饮食对雄性大鼠骨骼的影响与正常对照组相比，VLCD 组大鼠骨童减少，骨小梁面积百分率减少57%,骨小粱 数量（Tb. N)减少62%,骨小粱分离度增加307%,骨结 构变差，骨强度下降。动态参数中，代表骨形成的参数值 如荧光周长百分率、骨化沉积率和骨形成率均呈现无统 计学意义的增加。代表骨吸收的参数值如每毫米破骨细 胞数ft(N.OC/Tb. Pm)增加63%,背转化率指标如骨形 成率（RFR/BV)升髙【⁴³〜川。

(二） 低钙联合髙蛋白饲料致大鼠骨质疏松 的动物模型

操作步嫌：3月龄雄性Sprague - Dawley (SD)大鼠 20只随机均分为2组，每组10只。实验组大鼠摄食为灭 阑的低钙高蛋白饲料（CaO.025 % .protein 27 %),对照 组为灭菌的标准恂料（O丨％ .protein 18%)。连续喂养 6月后处死。观测骨代谢生化指标包括酶标法测定血淸 中的骨钙素（BGP)、伢源性碱性磚酸酶（BALP)，尿样尿 脱氧吡啶酚/肌酐（DPD/C>)，尿吡啶酚/肌酐（PYD/Cr >。 同时取骨标本进行钟形态计里学研究研究。结果，实验 组大鼠出现背小梁面积减少，骨小梁厚度显著变窄，#小 梁结点末端比下降，骨小梁间距增宽。电镜下骨小梁之 间缺乏有效连接，卄小梁明显变薄、变细；骨小梁分离度 加大，#吸收的程度较深，发生穿孔，微裂纹和微骨折的 微损伤明显增多，表现为与人类骨质疏松相似的病理变

化，骨结构衰畋骨代谢方面，DPD/Cr. PYD/Cr. BGP显著 升高，提示破骨细胞活性增加，与之偶联的成骨细胞也功 能活跃，骨转化率增加，骨重建的骨吸收大于骨形成，最 终导致骨质疏松^[<<]。

(三）   低钙联合低蛋白饲料致大鼠骨质藐松 的动物模型

操作步骤:30只3个月龄SD雄性大鼠，随机分为正 常年龄对照组（control)、极低钙组（VLCD, Ca 0.01%)、 低钙组（LCD, Ca0.3%>、低蛋白组（LPD, Pr8%),混合 组（CaO.01% +Pr8%)。3个月后取大賦左侧胫骨近心 端，行骨组织形态计童学分析。结果实验组对照组相比， VLCD和LCD组大鼠骨董均减少，背小梁面积百分率 (%Tb.Ar>分别减少 57% (P<0.01>和 40% (尸<0.

1.  ,代表骨形成指标如荧光周长百分数（L. Pm%)，矿化 沉积率（MAR>、骨形成率（BFR/BV)有增加的趋势。VL- CD组骨吸收参数如毫米破骨细胞数撤<N.OC/Tb.Pm) 增加63% (P<0.05)，呈现骨高转化的改变。LPD组大 鼠％丁1>. Ar减少57% (P<0.01>,#形成减少，骨吸收 增加不明显，皁低骨转化趋势。混合作用组骨量比申纯 低钙、低蛋自组显著降低，动态参数与VLCD组相比呈更 明显的骨高转化的改变，与LPD的低转化改变明显不 同。作者认为低钙饮食可使骨里减少并伴有骨转換增 加，而低蛋自、低钙饮食使骨转化增加更明显，#fi降到 更低¹⁴⁷¹。

(四）   用营养干预的方法制作骨质疏松动物模型

操作步骤：将3周龄Wistar大鼠按体策随机分为5 组，每组8只，饲料配方参照AOAC方法。第1组为对照 组（蛋白质18%,钙1.0% );第2组为低蛋白低钙组（蛋 白质8%，转0.025% );第3组为低蛋白中钙组（蛋白质 8%,钙丨.0%);第4组为高蛋白低钙组（蛋白质27.0%, 钙0.025%);第五组为卨蛋白中钙组（蛋白质27%,钙1. 0%),其余全价饲料均一致。动物词养20周，记录其体 重变化悄况，实验结束，进行大鼠全身骨密度测定， SPECT 骨显像，血淸 Ca, P,Mg,AKP,BGP.E2 测定，屎 HOP,Ca测定，股骨骨密度、长度、体积、湿重、去脂干重、 灰重和骨钙含S测定。胫骨及第三腰椎的病理学检査。 测定结果表明，低蛋白低钙，高蛋白低钙的两组动物的各 项检测结果均和对照组差异有显著性，符合骨质疏松的 表现，证实营养干预成功地制备了骨质疏松动物模型。 该研究结采也证实，骨质疏松是以骨世减少为特征，骨组 织显微结构改变和骨折危险频度增加的疾病。虽然在低 钙状态下，无论进食高蛋白还是低蛋白，都可建立骨质疏 松动物模型，但离蛋白饲料组的生长状况接近于对照组 动物，故制作骨质疏松模型时以卨蛋白饲料为宜^[48]。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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