成都华西华科研究所分析糖皮质激索致骨质疏松动物模型与QCT骨密度软件体模检测

糖皮质激索致骨质疏松动物模型（Glu­cocorticoids -induced osteoporosis in animals)

基本顷理：临床内科治疗发现，糖皮质激索K期使用 或虽间断使用但用最过大，都可引起骨质琉松，其特征为 易发生自发性骨折。糖皮质激索长期大世应用所造成的 骨质疏松症的发病率仅次于绝经后妇女骨质疏松及老年 性骨质疏松痖，闹居第3位。W此，其继发的骨庾疏松是 现代医学亟待解决的里要问题，其发病机制及顼防也越 来越受到菹视。骨质疏松症的共同病理特征是全身#世 减少，即骨基质和讶矿物呔同时减少，而糖皮质激索性骨 质疏松与原发性骨质疏松有者不完全一致的生物学特 征。m发性骨质疏松症主要是通过内膜表面ft■的吸收而导致皮质骨变薄，在骨車建的过程中又造成骨吸收大于 骨形成的失衡状态，因而导致#戤丢失，它的特征是骨吸 收不变或增加，而骨形成则随年龄的增加而减少；而糖皮 质激素所造成的骨里丢失主要表现为显著抑制松质骨的 骨形成、增加骨吸收。可在大鼠模沏上发现骨小梁的面 枳百分数喊少，小梁厚度变薄，数目减少，分离度增大，另 一方面糖皮质激素也抑制讶外膜面的骨形成，促进骨内 膜面的骨吸收，使得骨皮质变薄，#餹腔变大^[22‘~。本模 增是根据糖皮质激索对骨的作用特点，用药物诱导继发 性骨质疏松建立动物模明。

(一）   糖皮质激素致大鼠骨质疏松动物模型

操作步骤：取3月龄大鼠，喂以醅酸泼尼松，每次剂簠为4.5m_K/kg，每周2次。对照组喂生理盐水，在同等 条件下饲养90d左右，喂以醏酸泼尼松的动物可形成骨 质疏松。所有动物悯养时，均可自由摄水和摄食，处死动 物前10d和2d,分别皮下注射四环素（25mg/kg)和钙黄绿 岽（cal_Cein_;5mg/kg)，W四环索能整合钙并主要沉积在新 形成骨基质钙的起点，在骨表面形成黄色荧光，而钙货绿 索也能整合钙并沉积在新形成骨基质钙的起点，在骨表 面形成绿色荧光，两次注射标ici物可在骨表面形成双层 荧光，双层荧光可反映出注射标记物期间（10天）骨形成 的情况。饲养90天后，取胫骨上段作骨组织形态计a学 测定。用类固醉组与对照组相比，对大鼠胫骨近端骨组 织形态结构影响具有下述特点.•①骨量鉍著减少，表现 为骨小梁面积百分率（Percent trabecular area , %Tb.Ar) 减少，骨小梁数目（Trabecular number, Tb.N)减少，# 小梁间隙（Trabecu丨ar separation，Tb. Sp)增加。②代表骨 形成的动态参数值显著减少：荧光标记周长百分率（Per­cent labeled perimeter ， ％ L • I)m) 减少 ，单 位骨小 梁周长 骨形成率[Bone formation raie(Surface), BFR/BS]减少， 单位骨小梁面积骨形成率[Bone formation rate(Area)， BFR/BV]减少，单位對小梁体枳伢形成率[Bone forma­tion rate( Volume), BFK/TV] 减少； ③代表骨吸收的动 态参数值显著增加：破伢细胞单位周长百分率（Percent osteoclast perimeter, %OC. Pm〉堆加丨²*.〇

(二）   糖皮质激素致小鼠骨质疏松动物模型

操作步骤：3月龄昆明种雌性小鼠，随机分为4组，每组6只小畝，对照组（control)生理盐水灌肖，其余3组 (泼尼松低、中、典剂0组）分别给予泼尼松0.75mg/(kg- d) ;1.5mg/(kg*d) ;6. 3mg/(kg*d)(前两个剂里据成人用 坩换算，最后的剂镦据我们以前实验的大鼠用里换箅）瀨 宵，共给药2丨d,动物在(24 ±2>X：.相对湿度67%环境下 自由摄水、摄食.每3d称重1次。小鼠在处死前10d和 ■3d M次分别给予四环素30rr»g/kg和Calcein，mg/kg标 id,以在背组织形成双荧光标记。给药21天后小鼠眼球 放血处死，取软组织称重，分离左右_胫骨，固定于10 % PBS福尔马林液丨2 h，右侧胫骨按硬组织切片法制辂成

薄片和8pm厚片，其中4pm薄片用Masson Go丨dner 染色，8/xm厚片用于荧光观察，骨片在距骺线〇. 25 mm

处至远端2.5 mm范围内进行骨组织形态参数澜S。骨 静态参数包括测M参数：骨组织面积（T. At)，骨小梁面 积(Th. Ar)，皮质骨面积(Ct . Ar)。计算参数：舒小梁面 积0■分数（％Th. Ar)，骨小梁宽度（Th. Wi >，骨小梁数 «(Th. N)，#小梁分离度（Th. SP)，皮质骨面积百分数 (%Ct.Ar)和总骨量面积（％Bone)其中％(：1如和％8〇1^ 为本实验新堵参数，％Ct.Ar=(ct.Ar/ T.Ar，+Ct. Ar) X 100%,而％3〇116=(丁13.八『+(：1.^\1)/( T.Ar + Ct.Ar〉x 100;小鼠骨小梁表面及内皮质骨表面（endocortical sur- face)的双荧光标记强度按分级记录：± :很弱；+ :弱；+ + :强；+ + + :很强。结果，小鼠骨形态学与大鼠相似， 但松质骨骨童个体差异大。形态学中骨里与骨钙含景有 正相关（P<0.05>。对不同剂fi泼尼松作用的检测表 明：低、商两剂M泼尼松对骨钙含M无明显影响，中剂里 可增加骨钙含儇（P<0. 05);骨形态计量学观察可见低、 中剂里的泼尼松有增加骨ft的趋势，中剂1差异有M著 性（P<0. 05),高剂最泼尼松有减少骨t的趋势。中剂 擻增加松质#表面双荧光强度（尸<0.05)。结论小鼠背 形态学特征和骨钙含M有低的相关关系，泼尼松低的剂 馕可增加小鼠的骨钙含里、骨ft和骨小梁表面荧光，当剂 最增加时却有减少骨S和骨表面荧光的作用。提示建立 小鼠骨质疏松模甩必须采用商剂承的泼尼松^U51。

四、维甲酸致骨质疏松动物模型（Osteoporo­sis induced by retinoic acid}

基本取理：维甲酸（Retinoic acid, RA)又名维生汞A 酸，有广泛的生物学活性。目的RA常用于肿瘤和银屑 病笄的治疗，但维甲酸对伢质葙明显影响，具有致骨质疏 松的副作用，用药过程中多引发骨痛，a有文献报道，维 甲酸可促进成枵细胞的增值和分化，又可增加破骨细胞 的#吸收，造成高转化型的骨质疏松。H前维甲酸诱发 动物骨质疏松換型已被国内许多学者采用。实验给大鼠 灌肖70mg/kg，连续用药2w,可以导致大鼠骨质疏松¹²⁶¹。 但近有报道，大鼠灌W连续用药3w,毐副作用很大，小剂 爾:维甲酸（30 mg/kg)对骨代谢影响较小，大剂M维甲酸 (70mg/kg),毒性作用很大，大鼠致死率很卨，达50%以 上。（20只实验大鼠存活9只），且血淸学指标，如血钙、 磡、ALP变化明M,与骨质疏松状态下这些指标基本在正 常水平或稍低的亊实不符。故研究者认为，维平酸造成 的大鼠骨骼病变非骨质疏松状态而更似骨软化，不笪作 为研究骨质疏松病理状态的动物模甩^[271。

(一）维甲酸致大鼠骨质疏松动物摸型

操作步骤：取3月龄SD大鼠，随机分为对照组和维 甲酸模沏组，后者连续灌肖维甲酸70mg/(kg.d),21d后 处死并取内脏称重，胫骨中段制不脱钙骨片用半自动阁 象分析仪进行测算和分析。结果可见维中酸组卵巢重窜 M著减轻，子宮萎缩；胫骨中段总面积无明显变化，侣背 髄腔变大，皮庾变薄；骨外脱动态指标变化不显著，而内 膜面荧光煳长百分率、骨形成率与骨吸收均有增商趋势， 呈骨高转化型骨质疏松的改变^(M1。

(二）维甲酸致小鼠骨质疏松动物模型

操作步骤：取昆明种雄性小鼠40只，普通级，体重 (20±2〉g,随机分成4组：分别为正常对照组、高剂贵维 甲酸150mg/(kg*d)模型组、中剂里维甲酸70mg/(kg-d) 模型组、低剂最维甲酸35mg/(kg*d)模型组；每组10只， 每天灌肖1次，共14次。实验过程每周称重1次，于实 验丨5d处死动物，取肝、脾、胸腺称审，并取右股骨供渊定 用。结果不同剂童维甲酸均分别致小鼠骨干重减少，骨 横短径滅少，背基质的主要成分骨羟腩氨酸减少，骨矿物 质也有不同程度的减少；骨羟脯氨酸及骨钙的减少与骨 干重的比值密切相关，但骨磷、镁、锌的减少呈非等比例 性减少，尤以骨锌明显。实验提示维甲酸3种剂最均可 引起小鼠以骨量丢失为主的骨质疏松，并呈撤效关系，其 特征是骨钙及骨轻脯氨酸等比例性丢失，早期以#磷、 镁、锌的明敁丢失为主，#锌在维甲酸致骨质疏松模型中 可能发挥章要作用m’³⁰¹。

五、d_半乳糖致衰老性骨质疏松动物模型

(Osteoporosis induced by D-galactose)

基本原理：已报道D-半乳糖可致袞老，自1985年 以来许多学者运用D-半乳糖建立衰老模型，进行抗衰 老药物筛选。我们的研究发现D-半乳糖可致雄性大M 发生骨质疏松，主要机制是I)-半乳糖可致雄性大鼠的 皋丸的结构功能发生损害，导致雄激家低下。D-半乳糖 对雌性大鼠不能导致骨质疏松^[313。

(一）   大鼠d-半乳糖致衰老性骨质疏松动 物模型

操作步骤：3月龄SD雄性大鼠按体重随机分为4 组，分笼饲养，自由摄水摄食，每星期称重一次。对照组 皮下注射生理盐水，半乳糖组分别皮下注射D-半乳糖 低、中、高三个剂煨，低、中、高三个剂量分别是50mg/ (kg.d)，100mg/(kg. d), 200mg/( kg. d> ,注射体积是 0. 2mL/H)0_g<, 2个月后，心K取血处死大R,分离血淸，取 出左侧胫骨，脱水包埋，制作8_Mm非脱钙钟切片，用二甲 苯透明后用树脂封片，用图像分析仪测母静态参数。同 时取出左侧股背迸行骨钙、磷等元索测定.血淸用血糖、 甘油三脂测定试剂盒检测血糖、血甘油三脂。取出睾丸 称重后闶定脱水切片，进行组织病•理学观察。结果雄性 大鼠骨小梁百分率、骨小梁数目明显降低，骨小梁间隙增 宽，骨分离度明显增大，说明了骨#减少，骨呈现背质疏 松表现。同时组织病理学观察睾丸曲细精符排列紊乱. 管腔增大，宵壁变薄，间质增厚。说明睾丸组织发生损 害.实验证明D-半乳糖可使雄性大鼠产生骨质疏松，其 原因可能是睾丸受损有关^[il1。

(二）   小鼠d_半乳糖致衰老性骨质統松动 物模型

搡作步骤：

方法1:断乳雄性BALB/c小鼠，体重19〜20g，将小 鼠随机分为2组，分别是#年组和模铟组。模型组在喂 饲过程中以1.2g/kg.d,在颈背部注射D-半乳糖，靑年组则注射等ft的生理盐水，连续注射4个月，选血淸过轼 化脂质分解产物丙二醛（MDA)有显著升高者为衰老模 型组。另设16月龄同品系小鼠为老龄对照组。3组均 为i5只，自由进食和饮水。4个月后，断头取血，分离血 清，用试剂盒测定血淸中丙二醛（MDA),并对靑年组、模 S组和正常老龄组进行股骨长度、里馕、最大载荷和功、 讶钙、磷、镁、锰、以及钎羟脯氨酸等指标的检测与比较。 结果模型组最大载荷和功、骨钙、镁、锰及羟脯氨酸含M 均比靑年组有M著降低（P< 0.01),而骨磷含虽比靑年 组有显著升高（PC0.0U,这些变化与自然袞老组的变 化趋势一致，并且自然袞老组改变更为明显。结论长期 大里的使用D-半乳糖可能导致骨质疏松症

方法2:昆明种3片龄雌性小蚨20只，随机分两组： 正常对照组及半乳糖组。半乳糖组每H颈背部皮下注射 D-半乳糖1000mg/(kg.d)，正常对照组每H颈背部皮下 注射等体积生理盐水，连续42天，实验结束时，取右侧股 骨，测定骨千重、#羟脯君:酸、骨微燉元岽。同时，取血检 测血中过氧化氢醵（CAT)、谷胱甘肽过铒化物稱（GSH -Px)、血淸中丙二醛（MDA)、红细胞超氧化物歧化酶 (SOD)。结果D-半乳糖组小鼠右侧股骨干重、羟脯祆 酸、骨钙M著减少，与正常对照组比较差异有统计学意 义。说明了D-半乳糖皮下注射可导致小鼠骨质丢失， 其导致小鼠骨丢失的作用机制能与其加强背吸收，影 响成骨细胞功能有关。此外，该研究提出D-半乳糖导 致小鼠骨丢失可能与骨镁减少有关，而抗氧化酶活性降 低可能在其屮起歌要甚至是关键作用。在I)-半乳糖导 致骨质丢失的病理进程中，自由基可能是镁与#质丢失 之间的中介体，或者镁影响抗氧化酶活性，两者的相互关 系值得进一步探讨。同时，应用自由基淸除剂或补充镁 剂也许可以延缓D-半乳糖导致的小鼠骨质丢失^iMl。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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