成都华西华科研究所分析T2D易感基因在胰岛素分泌中作用与糖尿病早期无创检测诊断方法

摘要：2型糖尿病（type 2 diabetes ,T2D)是由胰岛素抵抗及P细胞分泌缺陷引 起，受到环境，遗传等多因素的影响，其中遗传因素在T2D的发生发展中起到重要 的作用。目前已报道大约40个与T2D相关的易感基因，但这些基因的变异大多对 T2D致病“贡献较低”。本文将对在胰岛0细胞中高表达，参与胰岛素的合成和分 泌且对T2D致病贡献较高的15个易感基因进行归纳总结即：参与胰岛素合成，胰岛 P细胞敏感性及0细胞内胰岛素运输的易感基因，并对基因突变应用于T2D的预防和 治疗做简单介绍。

关键词：基因突变；2型糖尿病；胰岛素分泌；早期筛查

T2D是一种极为普遍的流行性疾病，全世界的患病率快速增加，目前我国成人 中T2D的发病率已为9.7%,糖尿病人达到9200多万，患者人数居世界首位。T2D 不仅与环境因素如高糖摄入、缺乏运动等相关，还与遗传因素高度相关。随着基因 组范围关联研究（genomewideassociationstudies，GWAS)技术和 Meta-分析（meta­

analyses)的发展，发现了 一批与T2D发病相关的单核苷酸多态(single nucleotide

polymophism, SNP)位点，这些位点所在的基因在胰腺@细胞内，通过作用于@细胞 不同生理病理环节来影响0细胞功能，对T2D患者一级亲成员进行的高糖及正糖-高 胰岛素钳夹研究发现，T2D患者一级亲成员都存在不同程度的胰岛素分泌缺陷，而 胰岛素抵抗不明显，提示影响胰岛素分泌的基因突变可能是个体易于发生T2D的关 键易感因素^[75]。本文将对在胰岛0细胞中参与胰岛素的合成和分泌且对T2D致病贡 献较高的15个易感基因，进行归纳总结即：参与胰岛素合成、胰岛P细胞敏感性及 胰岛素运输的易感基因，以便于人们更好的认识到参与胰岛素合成、分泌相关基因 的重要性。另外，利用T2D相关SNP进行T2D早期的基因突变筛查诊断，有可能 为预防和治疗T2D带来新思路。

1 T2D易感基因的发现

T2D是由多个基因突变影响的遗传性复杂疾病，与SNP位点高度相关。其它突 变如：缺失、重复及插入也可能会起一定的作用，但这些突变发生率较低。

随着研究手段和技术的进步，T2D的遗传学研究大致可分为两个阶段。第一阶 段采用微卫星标记和家系连锁分析技术，主要发现了 PPARG、KCNJ11和TCF7L2 等相关基因。2003年人类基因组计划和2005年国际HapMap计划的相继完成，使得 T2D的遗传研究进入一个新的阶段：应用GWAS进行相关性研究，该方法采用简便 的频率检验从而发现与特定复杂疾病相关联的遗传变异(SNP、基因或DNA区域)。 由于GWAS的各种研究设计方法以及遗传统计方法无法从根本上消除人群混 杂、多重比较造成的假阳性，因此需要通过重复研究来保证遗传标记与疾病 间的真关联。但不同种族之间的人群差异和环境差异，使同一基因的突变在 不同人群中表现程度不同，不同研究的结果很少能互相验证和重复。因此有 必要将针对同一种疾病的各个GWAS研究集中联合分析，以便提高统计把 握度检测出更多的遗传关联，也便于对各个研究结果的一致性和异质性进行 考察和评估，这样Meta分析越来越得到重视和应用。目前在GWAS与Meta 分析的研究下，有大约40种T2D易感基因被发现，但是这些基因的变异大多“贡献 较低”或是常见变异。通过分析SNP位点和葡萄糖刺激的胰岛素分泌的关系，发现

P-catenin构成二聚体，调节多种基因的转录包括胰岛素基因、肠高血糖素原基因、肠 降胰岛素受体相关基因、胰岛素前体降解相关蛋白基因以及对P细胞分裂至关重要的 基因等^[77]。Shu等^[78]用siRNA处理的人胰岛中TCF7L2基因，结果胰岛P细胞凋亡增 加5倍，P细胞增生减少2.2倍，葡萄糖刺激的胰岛素分泌也减少2.6倍；相反， TCF7L2基因过表达可保护胰岛免遭慢性高血糖和细胞因子介导的P细胞凋亡和功能 损害，因此TCF7L2对维持胰岛素分泌和P细胞生存是必需的。用siRNA干扰 TCF7L2可引起人胰岛内胰高血糖素样肽1 (GLP-1)受体(GLP-1R)和葡萄糖依赖性 促胰岛素多肽/肠抑胃肽(GIP)受体(GIPR)表达减少，并伴有GLP-1和GIP引起的 AKT磷酸化减少，而过表达TCF7L2可恢复胰岛内GLP-1R和GIP-R的蛋白表达， 其他学者的研究也表明，GLP-1R和GIP-R的表达依赖于TCF7L2的表达^[79]。

TCF7L2变异亦可影响胰岛素原到胰岛素的转换，激素原转化酶1(prohormone convertase-1, PC-1)和PC-2的外显子和启动子上都有TCF7L2的结合位点，这2种基 因均受胰岛TCF7L2表达水平的正向调控。而PC-1和PC-2是前胰岛素加工为胰岛 素过程的重要蛋白质，当PC-1或PC-2功能缺陷，会导致成熟的胰岛素减少，继而 引发T2D,但其作用机理需要进一步研究。另外，TCF7L2蛋白水平的减少还可使参 与胞吐作用的蛋白如SLC30A8、STXBP1等的表达减少^[80]。该基因上的5个SNP即 rs12255372、rs7903146、rs7901695、rs11196205 和 rs7895340,均与 T2D 致病有很强 的关联性，尤其是rs7903146，多个研究证实了 TCF7L2基因变异与胰岛素分泌功能 减退有关，但是否与胰岛素抵抗有关尚不清楚。另外TCF7L2突变对抗糖类药物的吸 收、运输和代谢有一定的影响，Pearson等^[81]对苏格兰1846例糖尿病患者，进行 TCF7L2突变对磺脲类和二甲双胍类药物早期药效反应的影响的研究，发现TCF7L2 突变降低磺脲类药物对T2D的早期治疗效果。

HNF-1a、1P及4a是肝细胞核转录因子家族的成员，在肝脏、肾脏、胰腺等组织 中均有表达。这些基因在胰岛P细胞中，参与转录因子调控网络，调节胰岛素基因的 表达，调节与匍萄糖的转运和代谢有关蛋白的表达及线粒体的代谢。在HHEX (haematopoietically expressed homeobox)和 IDE (insulin-degrading enzyme)间的连锁不 平衡域存在多个与 T2D 有关的 SNP: rs1111875、rs7923837、rs154421 和 rs2251101

等。HHEX是干细胞表达的同源基因，其编码的蛋白作为一种转录因子，是胚胎中 肝脏和胰腺发育所必需的^[82]，新近研究发现HHEX基因是Activin/Nodal、BMP和 Wnt信号通路的靶基因，HHEX的表达可以调节胰岛P细胞的增殖^[34]。另外IGF2BP2 (insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2)是编码胰岛素样生长因子 2mRNA 结合蛋白2的基因，属于mRNA结合蛋白家族，在胰岛细胞中高度表达，联合胰岛 素信号分子IGF2 (insulin-like growth factor 2)，参与胰腺的发育、生长以及刺激胰 岛素分泌。

3影响胰岛P细胞敏感性的易感基因

胰岛P细胞的敏感性主要包括胰岛P细胞对葡萄糖降解产生的ATP的敏感性、对 肠促胰岛素的敏感性，胰岛P细胞受到葡萄糖、激素等的刺激后会引起细胞膜的极化 和去极化。

KCNQ1 (potassium voltage-gated channel, KQT-like subfamily member 1)基因定位 于第11号染色体11p15.5，长约400kb，编码膜电位控制钾离子通道（IKs)的a亚单 位，通常称为KvLQT1。KCNQl基因突变与遗传性心率失常疾病有关，如家族性房 颤、长QT间期综合征等。KvLQT1在全身多个组织中均有表达，除心脏、耳蜗外， 还广泛分布于上皮组织包括胰腺和小肠等，由该蛋白构成的IKs与胰岛素的分泌有 关。Ullrich等用IKs拮抗剂293B处理胰岛素分泌细胞INS-1，膜片钳检测后发现 293B可以降低P细胞的电流输出量达60°%，且动作电位延长，明显提高胰岛素分泌 ^[83]。在口服糖耐量试验（OGTT)中证实，rs15290位点C风险等位基因与葡萄糖刺 激的第一时相胰岛素分泌降低及血浆中GLP-1、GIP表达水平降低有关^[84]。由于胃肠 中的IKs主要参与激素和电解质的转运，推测广泛分布于胃肠道的KCNQ1有可能在 GLP-1、GIP的转运过程中发挥重要作用。

KCNQ1基因是首次以亚洲人为对象确定的T2D相关易感基因，在日本和欧洲人 群中的研究中均认为在KCNQl基因内含子15上，rs2237892、rs2237895和 rs2237897与T2D致病相关。Liu等^[60]对中国大陆人群的研究结果也支持此结论。同 时，Liu等还通过测试rs2237897单独变异的效应，发现其与T2D的关联最强。Jana 等^[85]在高葡萄糖钳夹试验中发现rs2237892位点与葡萄糖刺激的第二时相胰岛素分泌

有关，且证明若该位点携带风险等位基因T则可使血浆中甘油三脂、胆固醇增高， 认为KCNQ1亦与脂类代谢有关。

MTNR1B (melatonin receptor)是褪黑素受体，包括 MTNR1A 及 MTNR1B,研究

认为褪黑素与褪黑素受体结合后，促使MTNR1A、MTNR1B与肠促胰岛素受体如 GIPR、GLP-1R等结合，以阻断肠促胰岛素对腺苷酸环化酶（AC)的活化，抑制第 二信使（cAMP，cGMP)的产生^[86]，这种潜在的效应将使依赖或非依赖蛋白激酶A 途径的胰岛素分泌进行性减少。KCNJ11 ( potassium inwardly rectifying channel, subfamily J, member 11)编码ATP依赖的钾离子通道亚单位一内向整流钾通道蛋白 (Kir6.2)。在胰岛0细胞中，该蛋白通过结合葡萄糖降解的ATP,调节钾离子内向 整流，从而使0细胞去极化，钙离子浓度的升高，触发胰岛素的释放^[87]。最近的研 究发现在高葡萄糖浓度的刺激下，CDKAL1敲除的鼠胰岛P细胞胞质内钙离子浓度升 高延迟或缓慢，且在膜片钳实验中ATP依赖的钾离子通道（Katp)对葡萄糖刺激的 响应能力亦减弱，另外葡萄糖刺激的胞质内ATP浓度也减少。在敲除CDK5/p35 后，并没有改变CDKAL1突变对0细胞胰岛素分泌的影响，因此认为CDKAL1突变 降低胰岛P细胞中第一时相的葡萄糖刺激的胰岛素分泌主要是通过降低Katp对葡萄糖 刺激的响应能力，减缓Katp的K+输出和降低Ca²+通道的活性。

4影响胰岛素颗粒运输的基因 4.1 WFS1突变触发P细胞内质网应激

WFSI (Wolfram syndrome 1)基因编码内质网的一个跨膜糖蛋白wolframin,该

蛋白由890个氨基酸组成，含有9个跨膜区，在神经元和胰岛细胞中高水平表达。 已证实该基因突变可导致Wolfram综合征，临床表现以尿崩症、糖尿病、视神经萎 缩和耳聋为主要特征。Xu等运用RT-PCR、western杂交及免疫荧光分别检测 Sprague-Dawley大鼠的E15.5、E18.5、初生鼠和成年鼠的胰腺中WFS1蛋白的表 达，发现WFS1的表达高峰出现在胰腺P细胞形成的关键阶段即：鼠胚胎18.5d，因 此认为WFS1蛋白与胚胎期胰腺0细胞的发育相关。rsl0010131、rs6446482、 rs752854和rs734312是该基因的常见多态性，且在英国人及犹太人中发现了与T2D 相关性。Franks等^[89]在欧洲人群中研究发现，在瑞典人中rs752854与减少T2D风险

相关，在亚洲人群中尚未见报道。尽管该基因导致T2D的分子机制尚不完全清楚， 但是敲除WFS1基因的鼠表现为葡萄糖耐受、内质网应激增加、P细胞减少以及胰岛 素分泌受损^[90]。研究发现WFS1主要分布于成年鼠胰腺P细胞内质网上，认为WFS1 的突变可能会改变内质网的稳态，继而影响胰岛素的合成及前体的折叠，近期研究 证实WFS1参与非折叠蛋白反应通路(unfolded protein response ,UPR)，UPR可减少内 质网内非折叠蛋白的积累，解除内质网应激，维持内质网的稳态。Takei等^[91]在 HEK293细胞中敲除WFSl基因后，内质网Ca²⁺浓度下降；相反，过表达WFSl，内 质网Ca²⁺浓度上升。内质网Ca²⁺浓度降低会导致内质网对蛋白质的折叠能力下降， 未折叠蛋白或错误折叠蛋白积累而触发内质网应激^[92]。因此推测WFS1突变可能通 过影响内质网Ca²+浓度进而影响非折叠蛋白反应通路，引起内质网应激。

4.2影响胰岛素分泌颗粒形成和运输的易感基因

SLC30A8 (solute carrier family 30 [zinc transporter], member 30)编码蛋白锌转运体- 8 (ZnT8)，位于胰岛P细胞中含有胰岛素颗粒的囊泡中，推测该蛋白有可能通过调 节胰岛素分泌小泡上锌的积聚，从而调节胰岛素的生物合成、活化及贮存^[93]。T2D 相关突变位点 rs10906115 和 rs12779790 分布于 CDC123 (cell division cycle 123 homolog )和 CAMK1D (calcium/calmodulin-dependent protein kinase 1D)基因间区域， CDC123编码细胞周期相关蛋白，而CAMK1D编码钙调蛋白激酶，与胰岛素分泌颗 粒的聚集有关^[94]，该区域的与T2D相关的作用机制尚需更多实验证明。Calpain10 (the cystein protease calpain 10)基因编码半胱氨酸蛋白酶 Calpain-10 (CAPN10)，其 作用机制是在葡萄糖刺激的INS-1细胞后，CAPN10通过感受胞浆Ca²+浓度，调节 F-actin重组装而影响胰岛素囊泡的运输及细胞膜上的胰岛素分泌^[95]。

5易感基因应用于T2D的预防和治疗

T2D是多因素影响下的复杂疾病，早期干预（饮食、运动、药物等）可以减缓 甚至逆转病程。美国糖尿病预防研究组（USDP)针对T2D高危人群，分别比较了生 活方式干预及二甲双胍类药物治疗对T2D的患病病程的影响，发现在2.8年的跟踪 试验中，生活方式的干预可以使患T2D的风险降低58%，二甲双胍的治疗亦使患病 风险降低31°%^[8]。目前T2D的临床诊断主要依据2010年ADA (美国糖尿病协会） 糖尿病诊断标准，即通过糖化血红蛋白、空腹血糖和糖耐量的相应指标来评估个体

患有T2D的风险性。但由于T2D早期发病的症状轻微而且这种诊断标准并没有涉及 发病的本质原因，大部分糖尿病患者并没有被尽早的发现和诊断，从而延误了预防 和治疗，加重病情。

随着现代医学的发展，人们对疾病治病机理的认识也不断深入，特别是人类基 因组测序计划（Human Genome Project, HGP)的完成，以及后基因组时代对基因功 能的研究成果，利用相关突变基因与个性化分子检测相结合，对人群进行基因筛 查，来预测和治疗相关疾病，成为研究的重要方向。美国已经开展了 20种肿瘤的基 因组项目及多种常见病的全基因组扫描，这些大量的基因研究更加深入地揭示了基 因与疾病的关系，同时这些海量的生物信息为个性化分子检测打下了扎实的基础。

目前多家公司将常见复杂疾病如乳癌、房颤等的相关突变基因与个性化分子检测相 结合，通过鉴定和检测个体的致病基因对疾病进行风险预测/诊断，进而选择最优方 案进行预防/治疗。

目前，美国的多家生物公司提供关于T2D基因筛查的早期诊断。通过基因检 测，了解个体对疾病的易感性，对不同患病风险的人群提供不同的健康管理方案， 降低危险因素，减少个体患病风险。不同的公司通过评估相关流行病学的研究，并 结合已发表的GWAS和Meta-分析的研究结果来筛选与T2D高度相关的SNPs。如 deCODEme公司（http:// demo.decodeme.com)通过检测21个与欧洲人群T2D患病 高度相关的SNPs来早期筛查欧洲个体的患病风险性，这些位点中大部分是参与胰岛 素合成与分泌的基因突变。23andMe (https://www.23andme.com)公司则针对欧洲、 亚洲人群均提供9个相同的SNPs检测位点，这9个SNPs都影响胰岛素的合成与分 泌。针对风险人群，结合心理、饮食、运动等因素，提供患病评估，并提出具体干 预措施，以降低或延缓糖尿病及多种并发症^[96]的发生。但在中国尚没有公司提供关 于T2D的基因筛查与诊断服务。

另外药物基因组学也可以加强治疗药物的针对性，由于病人遗传学上存在差 异，同样剂量的药物在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。通过基因检 测可揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异，预测病人对特定药物的遗传反 应，大大减少药物的副反应，提出最佳治疗方案。

6小结与展望

过去几年中，随着GWAS技术及Meta-分析的发展与应用，与T2D发病相关的 风险基因已达40个，其中的一些基因亦是其他复杂疾病的易感基因，如JAZF1和 TCF2的基因突变也与前列腺癌有关。大多数易感基因对T2D致病“贡献较低”，在 总结与T2D发病相关的易感基因的基础上发现，致病较高的易感基因往往参与胰岛 素的合成和分泌过程。但是由于T2D的遗传异质性和表型异质性，其发病机制不仅 牵涉到基因间的相互作用还涉及基因与环境的相互作用。因此在未来进一步加强基 因与基因、基因与环境的相互作用以及单体型研究，对于理解和运用遗传变异来预 防和治疗复杂疾病显得尤为重要。

T2D易感基因应用于疾病的早期预防与治疗将为T2D患者带来新的希望，但目 前这种诊疗方式的推广尚面临着诸多挑战。一方面，高昂的诊断费用与实验室设备 需求，挑战着分子诊断产业的成本利润。医疗保险和报销障碍、知识产权的保护力 度不足、全球对分子诊断审查、批准与监管滞后等问题又使分子诊断的发展套上了 一副枷锁。另一方面关于T2D的诊断检测技术目前并不成熟，检测并没有综合一些 临床风险因素如性别、年龄、人群风险等，也没有详细评估基因早期筛查对于T2D 诊断的准确度，如何提高SNPs筛查风险人群的准确性，将进一步决定T2D早期基 因筛查的临床应用价值。

成都华西华科研究所研发生产多种糖尿病及并发症早期无创检测诊断系统

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