成都华西华科研究所分析分子生物化学研究中要评估成熟OC骨吸收活性与QCT骨密度软件体模检测

分离高度浓缩的融合前OC和完全成 熟的OC

在分子和生物化学研究中要评估成熟OC的骨吸收 活性和功能调节，斋要制备由大适纯化OC组成的细胞 悬液，并能在矿化物质上培养这些细胞。但是，上述方法 获得的OC纯度不够，数H不足，难以控制种植在牙本质 或骨片上OC数目，如前述用肌动蛋白E和EDTA处理 在塑料皿t培养的混合骨细胞，成功分离了纯化的OC。 但由丁 OC牢固地附者在塑料底物上，不能从底物上分 离出来，制备细胞悬液；不能将纯化的OC转到牙本质或 骨片上评估其骨吸收活性。要克服上述分离纯化OC的 问题，Weslowsk丨等（1995)和Kakudo等（丨996>分别建立 了分离融合前OC和完全成熟OC的方法，成功制备高纯 度的细胞悬液（>95%)。用这些分离方法进行研究，将 揭示真正OC的形成和功能^:UM71。

1.用ECH1STAT丨N处理方法分离融合前鼠OC 杀死6大Balb/C鼠，无歯分离胫骨和股骨₃切开骨端，用 27号针吸取丨mLa-MEM培养液冲洗髄腔。然后将骨 «细胞悬浮在a-MEM培养液中，用70^tm尼龙网过滤。 再用MEM洗涤，在300g离心7min收集细胞，悬浮 在含10%FBS的a- MEM培养液中，以25000个细胞/ cm²的密度种于鼠成骨样细胞MB1.8之上；在此之前以 10 000个细胞/cm²初始密度已将MB1.8细胞种于培养 皿中，在含有10%的FBS和1,25(01丨)₂Dja-MEM培养 液中孵育48h。MB1.8细胞是从新生鼠颅骨建立的细胞 系，显示了许多成骨样细胞的特征。而且，这些成骨样细 胞能够支持骨髄细胞分化为破骨细胞。每2d换一次培 养液,6d后，许多单核和一些多核TRAP阳性细胞出现 在这个共同培养体系中。然后用PBS洗涤培养物用胶原 酶(Wako Pure Chemicals，lmg/mL in PBS)/中性蛋白麻 (Boeringer - Mannheim，lmg/mL in PBS)在 37)3 处理 20min。通过酶消化和随后的三次用PBS洗涤，大多数成 骨细胞样细胞从培养皿中去除掉。余下的细胞用含30nM echisiatin 1 % BSA 的 a - MEM 液中在 37U/ 肖 20min。通过离心收集经echistatin处理的细胞，用含 10% FBS的a-MEM液再洗涤，将细胞置于骨片或盖玻 片、或培养板的孔中。

此法的原理是；在存在成骨样细胞的情况下鼠骨髓 细胞能够分化为破背细胞并且OC细胞膜上表达丰苗的 粘连素受体（a_v札）。echistatin是含有KGD的蛇毒，与具有较高的亲和力，能抑制骨髓细胞和成骨样细胞 共同培养体系的破骨细胞样MNCs的形成及破骨细胞样 MNCs的附着和功能。骨髄细胞和成骨样细胞与 (30nM)echistatin共同辦會• 6天，去除成骨样细胞和其他 胶原酶敏感细胞，可以产生88%〜95%纯化TRAP阳性 细胞，每150cm²培养皿产生1.5X丨〇^s个细胞。在这些 分离的TRAP阳性细胞中，其中75%〜90%为单核细 胞，其余为含有2〜4核的多核细胞。这些细胞表达丰宮 的降钙素受体，与降钙岽反应时产生大嚴cAMP，但对 PTH无反座。当这些细胞E新种于MB1.8细胞上，在 1,25(0丨丨)₂D₃作用下，单核细胞能够彼此融合形成能吸 收骨的TRAP阳性多核细胞。但是，如果这些细胞单独 坊养，无论是否存在丨，25(OH)₂D,_;或存在MB1.8细胞， 却不存在丨，25(OH)₂D_i;这些细胞都不能在#片上形成 吸收陷窝。肌动蛋白环的形成与TRAP阳性多核细胞形 成和吸收餡窝的形成同时发生。说明成骨样细胞如 MB1.8是TRAP阳性单核细胞分化为功能性破骨细胞 所必笛的。分化细胞也高表达《Vp3整合索、背桥索、金 属蛋白酶9、丨丨型碳酸酐酶和OC-2的mKNA。此外，分 化细胞显示丰宮的磷酸化PPc-src,被认为与破骨细胞 的信号转导、黏附和功能有关。基于上述特征，此分离的 OC是功能前纯化OC.对OC的分子学研究有很大帮助， 有助于阐述OC分化最终步骤的机制

2.在悬液中分离兔完全成熟破骨细胞

1.  制备胶质凝胶在冰上试忏内快速将8mm

1.  3% 1 型胶原凝胶液（Nitta Gelatin, Osaka，Japan)与 lmL 10 倍的 a - MEM 和 lmL 0. 2M HEPES/NaOH (pH7.4)含2.2%NaHC0₃的溶液混合，将这种混合 溶液倾注到一个100mm的培养皿中。通过37T： 3h的 孵f凝胶完全聚合，之后加含596FBS的a-MEM .将其 放入含5% COz的湿润C〇2孵育箱中备用。

2.  制备混合骨细胞如上所述，从10d大小兔的 胫骨、股骨、肱竹、尺骨、桡骨制备混合骨细胞。

3.  OC的分离垴养将lx 1〇«个兔混合骨细胞种 于凝胶上，加人含5% FBS的a-MEM培养液培养4h; 用预热的PBS洗掉未附宥细胞和小骨片后，用5 mL含 有0.001%蛋白酶£和0.02%£0丁八的溶液在室温处理 5min,以去除未附苕造血干细胞和凝胶上附者较松的基 质细胞。然后，用PBS洗3次.加入5mL含0.01%细菌 胶原酶的PBS液，在室温作用5min。通过用稀释的胶原 酶处理，大多数凝胶面上的基质细胞完全从底物卜.脱落， 而破骨细胞仍保留在凝胶中。用？路洗涤数次后，加人 5mL0.1%胶原酶，在37X：消化凝胶lOmin,使保留在凝胶中的细胞释放出来，收集释放的细胞，用低速离心机洗 涂（500r/min 2min)，悬于 5mL 含 5% FBS 的 MEM 液 中。取50；xL悬液注人塑料培养皿中孵育20分钟，在此 短期的孵育期间，所冇活破骨细胞都附着在培养皿上。 在丁KAP活性染色之后，计数含3个以上的TRAP阳性 MNCs。将（100 200个〉破骨细胞种于％孔培养板内的 牙本质片上，培养液为含5% FBS的a-MEM液，过了 适当的时期，对培养板(6 mm直径）上的破骨细胞进行活 性染色，并对骨吸收陷窝染色。

原理：基于破骨细胞比非破骨细胞对胶原凝胶有更 强的附者力的脓理设计此方法。尽管R前骨细胞黏附力 差别的确切原因仍不淸楚，一些黏附分子包括a_vft(l型 胶原受体）和aV淖可能存在差异。此方法，从每只兔可 获得纯化率>95%的TRAP阳性细胞2 000〜30 000个， 可获得纯化韦接近90%的多核的破骨细胞。分离出的 破#细胞形状呈致密的圆形，很可能就始体内的顷形，不 象在体外塑料培养皿上的形状，且高水平表达降钙索受 体。将此破骨细胞种于牙本质片上2h后，就能吸收牙本 质，在24h内陷窝面积增加，增加的輻度取决于种棺破骨 细胞的数说明用此方法分离的破骨细胞是完全成熟 的和具有功能性的。但24h后，牙本质片上破骨细胞数 目逐渐减低，说明分离的破骨细胞寿命短。降钙素抑制 分离细胞对牙本质的吸收活性，而丨，25(OH)₂D,或PTH 并不影响骨吸收。与前述的鼠融合前破骨细胞相反，此 种兔分离破骨细胞甚至在缺乏基质细胞的情况下，仍能 吸收牙本质。但是基质细胞能增强兔破骨细胞吸收活 性，并延长其寿命。此外，存在基质细胞的悄况下，1,25 (OH^Dj能增强吸收牙本质的活性。因此推测骨基质细 胞马能是破骨细胞分化最后一步，或对激索或局部因子 起反应所必莴的，但对完全成熟破骨细胞的基本#吸收 活性并不总是必要的。这种方法可能适用于评估成熟破 骨细胞骨吸收活性，因为可控制培养在牙本质片上的破 #细胞数目和纯化率。通过用这种方法，可检测预检激 素、细胞因子和药物对真正破骨细胞的直接作用，而且可 评估成熟破#细胞与其他骨细胞或骨基质之间的功能性 关系。遗憾的是不能从小鼠或大鼠的长骨或人骨巨细胞 瘤中用同样方法分离完全成熟的破骨细胞或破骨细胞样 细胞，或许是每一种屑破骨细胞生物学行为存在还不能 确定的差异所致^;16^^{2成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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