成都华西华科研究所分析原代成熟破骨细胞分离培养与QCT骨密度软件体模检测原代成熟破骨细胞的分离和培养（Isola­tion and 

(一）从新生鼠或兔长骨分离OC(Chambers 方法）

骨衣面上完全分化的能吸收骨的OC，对各种剌激因 素发生反应，如激索、细胞因子或存在于骨基质内及其他 骨细胞膜上的粘附分子。但是，有关OC骨吸收的调控 知识和分子机制仍不淸楚。要阐述这些问题，箝要从骨 组织中分离出具有功能特征的真正的OC。Chambers和 M_agmis(1982)首次建立了从新生鼠或兔长骨分离OC的 方法⁽"^:。下面描述的这种方法被广泛用于研究OC的 功能。

杀死出生在48h以内的鼠和兔，无菌条件下用精细 的镊子和手术刀将胫骨、股骨、肱骨、尺骨和桡骨剔出，去 除软组织，将骨头浸在冰冻的PBS内。在1〜的a- MEM或199培养液（lmL垴养液处理4个鼠的长骨）内， 将骨迅速纵向劈幵，用尹术刀片仔细刮骨面使骨碎婀进 人培养液内，用末端光滑的硅化玻璃忏或多聚丙烯管轻 轻吹打碎片。沉静10〜20s,让较大的碎片从悬浮液中沉 淀下来，收集上淸夜，加人含10%FBS培养液到预计体 积。按实验设计淸夜立即加入到盖玻片、骨或牙本质 片上或组织培养液内。在37X：孵育箱内孵眘30 ~60min，用含10%FBS的暧培养液轻轻去除非附者细胞， 然后加入培养液。细胞在湿润的〇〇2孵舒箱内（5%〜 10% CO^和90%〜95%空气）孵育至自己设计的时间。

种梢lh后，OC会伸展，在倒S光显微镜下很容易识 别。此方法的依据是OC比其它骨细胞对底物有更强的 粘附力。从每只大鼠能获得大约1 〇〇〇个OC,纯化率为 5%。当需要大MOC时，在底物上首次沉降的时间可能 延长，但纯化率将降低<1%。用这种方法，降钙素和一 些PG可直接抑制OC骨吸收〇成骨样细胞UMR细胞 在对l,25(OH)₂D₃和PTH反应时产生一些因子，可增 强OC的骨吸收活性。但是，这些刺激因子的特性仍待 阐明。因为OC难以纯化和数貴不足，这种方法仅限于 单一细胞的研究，相关技术操作如电生理学、免疫细胞化 学、组织化学和单一细胞分子技术。

(二）免疫磁珠分离鸡破骨细胞（Osdobys 方法）

Osdoby等（1991)用抗OC单克隆抗体（121F)涂层磁 珠分类技术，達立了一种能分离OC的方法，分离的鸡破 骨细胞纯化度高，数目较大。下面叙述搡作过程¹¹²、

分离鸡0C之前，先用羊抗鼠丨g(i与免疫磁珠混合， 制备抗0C免疫磁珠。然后收集免疫磁珠，用PBS洗3 遍，重悬于200_ML的PBS中。然后加人25/iL纯化的鼠 单克降抗体121F (600叫丨g)，上下完全混合后，在孵 育3〜6h₀

一组15只白Leghorn孵化鸡，喂正常饮食4〜6d,然 后维持低钙饮食（<0.2%钙）4w。将鸡杀死，无菌条件 下取出胫骨和股背，放在制冷的Hank’s平衡盐溶液 (HBSS)中。切断骨两端，用吸满HBSS的〖8号无南针 筲，从骨一端注人，冲出甘髄。去除骨上软组织后，将骨 纵向剖开，放在制冷的HBSS内，剧烈摇晃30s。摇晃使 细胞从骨中释放到溶液中，收集溶液，顺序通过350和 110 _Mm网孔的尼龙滤器。过滤的细胞（I部分）在4t：离 心10min(210g),这部分含有大M非活力的OC(<l%活 性OC)纯化率为30%〜40%。摇过的骨放在35mL含

1.  333mg/mL胶职觭的HBSS内/或Moscona’s低碳酸氢 盐（MLB)(2:1体积比）内，在37C孵痒30min。剧烈摇 晃后，溶液通过尼龙滤器，如上收集过滤所得的释放细胞 (II部分）。最后，胶原酶处理过的骨，在35mI.MLB内 孵育15min，然后转到35m丨含0.045%胰醃的MLB /或

1.  015%EDTA内，在37T：孵ff 30min。然后骨被剧烈摇 晃3min,如上收集细胞作为第三部分。每一细胞组分悬 于试管液体上层，试管内液体是35%Perco丨丨与HBSS以1 :5体积比例构成，在4t：以440 g离心20min。顶层的细 胞和交界面的细胞被收集、洗涤，并悬浮在HBSS内。2 mL细胞悬液覆盖在10mL6% Percoll/ HBSS液体顶端， 在4T：离心60min。收集富含OC的底部9mL细胞。里 新悬浮在10mL HBSS内。将洗过的与抗OC单克隆抗 体（12110偶联的免疫磁珠加人到细胞悬液中，在旋转的 摇床上孵育30min。在磁场中将吸附到磁珠上的细胞与 非吸附细狍分离出来。用HBSS洗涤粘附在磁珠上的

OC，如此几次。最后，OC重新悬浮到加5%FBS的1卯 培养液中，种植于塑料孔或骨片上。

在进行免疫磁性分类之前，I - 01部分OC纯化率 分别为~30%,30%和<10%_<)1和11部分〇0的活力 很低，而m部分oc活力大约〜5〇%。第m部分OC产生 比第1、n部分少。通过丨21F免疫磁性分类，D1部分可 获得大赣纯化OC。从15只鸡经典制备的(D部分细胞能 够产生〜2) x 1〇⁶个OC,活力>9596,纯化率>90%。 此种分离方法对许多分子研究有用，因抗OC抗体 (121F)与人OC有交叉反应，这种分离方法可能适于分 尚哺乳动物破骨细胞。但有些悄况这种免疫磁珠分类方 法对于分离纯化的OC不是同样有效，因为大最小的非 OC在分离过程中紧紧附着在OC膜上。

(三）巨细胞瘤（GCT)中破肯细胞的培养

巨细胞痛是发病率较低的原发性骨骼肿瘤，主要在 局部起溶骨破坏作用。GCT由不定数目的多核巨细胞 和单核基质细胞组成；肿疳细胞主要是指单核基质细胞， 而多核巨细胞是反应性细胞；肿瘤基质细胞诱导葬集循 环中的破筲细胞前体细胞，并促进其分化为功能性破骨 细胞。到目舫，GCT中多核巨细胞是唯一可用的人成熟 破骨细胞的来源。下面简述培养方法：无菌条件下，取出 肿物，在培养皿中用剪刀铰碎，用胶原_和dipase进行消 化处理。然后用含有10%胎牛血淸的a-MEM培养液 悬浮细胞，用可通过40pm大小细胞的滤器过滤。然后 细胞悬浮在培养液中进行培养应用^tl3]。

四、破骨细胞的分离纯化培养（Isolation, purification and culture of osteoclasts)

(一>分离鼠骨髓培养的胶原胶上新形成 的OC

在塑料皿t，牌或骨髓细胞和成骨细胞共同培养可 以产生大里TRAP阳性OC。但是，塑料皿上形成的OC 不能用任何消化酶从塑料皿上分离下来。但有种新的共 同培养系统,OC在胶原胶上新形成后，用胶原酶消化能 够从胶中释放出来¹下面介绍操做细节。

2.  制备胶原胶 7mL0.3% I型胶原（Nitta Geltin Co, Osak_a,J_apan)(将猪肌腱溶于酸中制备出来）与2mL 5父浓度₍₁-1^^1和1_〇11含有2.2%1^出(：0₃的0.2\1 HEPES/NaOH(_PH7.4)在一个冷冻的试管内快速混合,4 mL这种溶液注入到培养皿中。经过37t： 3h的孵f聚 合后，将含10% FBS的MEM加到凝胶面上，在湿润 的含有5%(^的孵育箱内孵育到所需要时间。

3.  如前述制备鼠骨髓细胞和颅骨成骨样细胞悬液。

4.   共同培养产生MNCs 骨髄细胞（lx 〜2X 1〇⁷个）和成骨样细胞（1 x 1〇⁶〜2X 1〇⁶个）同时种于涂有 胶原凝胶的100mm培养皿中，培养液为含有l〇%FBS和 10〜8Ml,25(OH>₂D₃ 的 a-MEM 培养液。在 37X：湿 润的COz孵疗箱（5% CA -95%空气）中培养◊培养 5〜6扼，用a-MEM培养液洗涤细胞，然后将4 mL含

2.  2%细菌胶酶的a- MEM加到培养皿中，在37X：水 摇床(60r/min)消化后，细胞从凝胶中释放出来，收集在 试管内，洗涤，重悬于Tyrode’s溶液中（100mm培养皿 lmL液体）。随后将细胞悬浮在4倍体积的含35% Per- coll的Tyrode ’ s液体上面，以250g离心20min。收集含 有大董MNCs的交界层，洗涤，悬于含丨0% FBS的a- MEM内。最后细胞种于塑料皿，或牙本质，或骨片上，培 养到所需时间。

5.  培养结果一个100 mm培养皿可获得大约 2 000〜40 000个TRAP阳性MNCs。细胞数纯化率达 5%,细胞核纯化率达30%。梯密度离心后MNC能恢复 活力30% — 40%。当细胞种于牙本质片上时，培养10h 细胞就能吸收牙本质，在72h内吸收陷窝面积呈线性增 长。这些细胞表达丰富的降钙素受体，吸收牙本质的活 件可被降钙素抑制。因此，分离的MNCs,炅有OC特征。 但应注意的是，这些在体外形成的MNCs可能和体内真 正的成熟的OC不完全一样。

(二）从兔混合骨细胞群分离成熟破骨钿胞

要研究真正破骨细胞的分子生物学和生物化学特 征、或评估成熟破骨细胞的功能，霈要大M真正的〇c,但 难以从啮齿类骨获得足够数目的成熟OC,因骨组织中 OC所占百分率太低（<0.01%)。虽然前面叙述人们可 以从低钙饮食的鸡获得较高纯化率的大* OC,仴免疫磁 珠分类方法技术复杂，而且鸡OC与哺乳动物OC有K 别；例如鸡OC降钙索受体表达水平低。尽管Akatsu等 (1992)建立了一种分离OC的新方法，既在胶原凝胶上， 骨髄细胞和成骨样细胞共同培养可形成OC,但是，分离 的OC纯化率和数目仍难以完全满足分子生物学研究的 黹要。因此需要有一种方法分离大设纯化的哺乳动物 OC。新生兔的长骨比啮齿类长骨含有更多的成熟OC, 这些兔的OC,在钟片或牙本质片上，比其他种类动物分 离并种植的OC有史强的吸收活性。Tezuka等（1992)建 立了从兔长骨分离纯化大MOC的简单方法

杀死10d大的兔，皮肤用酒精擦拭，用摄子和剪刀取 出胫骨、股骨、尺骨、桡骨和肩胛骨，去除软组织.放在冰 冷的含5%FBS的a - MEM内。在一个50mL的烧杯 内，置含5%FBSa-MEM培养液20mL,将骨放人杯中， 用锌利的剪刀将#剪碎20min。用搅棒轻轻搅动骨碎片 lmin,允许大块#残片沉淀2min，然后细胞部分移注到 冰上的一个50mL试管内。再将这种搅动、沉淀和移注 的操作过程電复一遍。将所得细胞汇合到一起，称为混 合（未分离）骨细胞〇计数活混合骨细胞的数R。通常从 一只新生兔能获得6 x 1〇⁸ — 8 x丨〇⁸个细胞。这些细胞 以1X10⁸个细胞密度种于丨〇〇_mm直径的塑料培养皿 中，培养皿含10 mL 5%FBS_a- MEM培养液，在37t：含 5%C0₂的湿润空气中放置2h,使细胞黏附到培养皿上。 然后在37T：用温和的a- MEM坫养液轻轻冲洗去除未 附稗细胞。然后加入10 mL 5% FBS新鲜a-MEM培奍 液，细胞培养18h。18h后，用温和的a-MEM培养液冲 洗培养皿再次去除非附着细胞，剩余细胞在同样培养皿内再培养4h。之后，这些细胞用PBS洗涤，含0.001%肌 动蛋白酶 E (kaken Chemicals，Toky;Japan>和 0.02%ED- TA的PBS加人到细胞中，在37t：继续孵育3-5min。然 后附着细朐（非OC)将从培养m上脱离下来。脱离的细 胞用PBS完全冲掉。

用这种方法可获得大M纯化（纯化95% )OC,从一只 兔大约获得3x l〇^s个〇C。此法可能也适于除鸡以外的 其它动物。鸡OC对槊料底物无亲和性。从鼠也可分离 纯化的OC但数M少。因为骨组织中的OC脆弱和具有 黏附性，在这种分离过程中可能会受到损客，因此建议从 骨中移出这些细胞时要快速轻柔，并在冰冷的试竹内保 存。此分离的多核细胞显示真正OC的标准特征：多核、 TRAP阳性，有降钙索受体（用放射自显影探测），通过收 缩和细胞内cAMP水平的增高显示对降钙索的反砬。但 因为OC坚固地粘附在頌料底物丨：，不能从底物上将纯 化的OC分离下来制备细胞悬液^ W此，不能将纯化的 细胞转到牙本质或骨片上以评估它们的骨吸收活性。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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