成都华西华科研究所分析破骨细胞体外培养与QCT骨密度软件体模检测

破骨细胞体外培养

因为难以分离oc,对oc的了解滞后于其他骨细 胞。.主耍由于OC数目相对较少，属于终末分化细胞，且 紧密附宥在骨基质上，细胞骨骼脆弱。因此一直没有建 立成功的破骨细胞或其舫体细胞系；但许多学者孜孜以 求，运用不同方法和技术研究OC的体外分离培养，促进 了对OC的了解。

本部分要介绍一些分离和培养OC的方法，依不同 策略这些方法用于既定的动物种厲中，分离OC时.纯化 度不同，产生细胞量不同。应该依据不同研究目的选择 不同的分离培养方法。

一、体外 OC 的形成（Generation of oste- oclasts in vitro)

(一）骨髄培养

1981年开始出现骨髄培养破骨细胞体系，众多研究 者对猫、兔、犬、和狒拂、以及人的骨髓进行培养，形成了 具有OC特征的多核巨细胞（multinucleated cells，MNCs〉： 多核,TRAP活性，降转素受体，对激素的反应，包括】，25 (O丨•OzDpPTH和某些细胞因子。但培养周期很长，需要 2〜3w。而且在某些情况下，特别是人骨髓培养所形成 的MNCs ,没有骨吸收能力，没有降钙素受体，并且经常 与多核巨噬细胞相混淆^[11。直到1988年才建立了鼠骨 «培养系统，在l,25(OH)₂D,存在下一周内就能形成 TRAP阳性MNCs,此MNCs满足大多数OC表型的标 准^:21下面叙述鼠骨髓形成OC的程序。

无菌条件下取6〜9d大小ddY鼠的胫骨，去除附苕 的软组织，用剪刀剪除骨两端，用25号尤灌注射针头，吸 取lmLa-MEM液从骨袖冲洗《腔，将细胞冲出。收集 骨髄细胞，低速典心冲洗（250g,10min)悬浮在_a- MEM

中，通过胎盘蓝染色评估细胞活力。一只胫骨可收集大 约1><丨〇⁷骨髄细胞。然后，骨髄细胞以7.5X 1〇⁵密度 每孔0.5mL种在24孔培养板中，培养板内培养液a _ MEM含有丨0%胎牛血淸（FBS)(其中含有各种因子），在 37^eC，含有COz的湿润的孵育箱（5% C0₂和95%空气） 中培养。骨髄细胞培养l~8d，每3d换液，去除0.4mL 旧培养液换上新培养液。经过恰当培养期后，细胞用 PBS洗一次，然后用乙醉丙酮（50:50,体积/体积）固定。 冻干每一孔，室温条件下用一种TRAP染液染色，以确定 TRAP活性。TRAP染液的组成：0.1M醋酸钠缓冲液 (pH5.0)含有 0.6mg/mL Fast red violet LB 盐，50mM 酒 石酸钠，和0.1〇1₈/〇^萘酚八5-\1\磚酸盐作为底物（在 N，N二甲酰胺中以10〇x浓度新鲜制备）。并且染液在 用之前要过滤。最后，含有=个核以上的TRAP阳性细 胞被认为是这个培养系统形成的OC。

许多因子包括 l，25(OH)₂D,、PTH、PGE2、IL- 1、 比-3、GM-CSF、M-CSF刺激此培养系统中TRAP阳 性MNCs的形成。刺激作用于培养第8天达最高水平， 可通过降钙家作用于受体而阻止。当鼠骨懺细胞被种于 牙本庾片上时，〇C性MNCs,能吸收牙本质，在牙片上形 成凹窝。90%以上TRAP阳性单核细胞蔟和MNCs位于 碱性磷酸醃阳性单核细胞集落周围；表明OC生成涉及 成骨细胞或#基质细胞。因为培养结果很大程度上受所 用血淸的影响，在实验之前要预先选择一种合适的血淸。 在l,25(OH)₂D;存在下，用相似的培养方法，大鼠骨髄 细胞也能培养形成OC。

(二）从小鼠造血原始细胞形成OC

骨髄细胞和混合骨细胞群不仅含冇OC祖细胞，也 含有大量与OC分化有关的基质细胞。耍评估亲骨性激 素和因子对OC形成的直接作用，芾要一组含夯大s OC 祖细胞的细胞群（不含骨基质细胞>。造血T细胞和未定 向的原始祖细胞在牌和骨髓内很丰宮，提示在某种条件 下从牌细胞形成OC的可能性。此外，脾细胞不含任何 骨基质细胞。因此建立了无任何基质细胞的从造血原始 细胞形成OC样细胞的方法W。

以150ing/kgbw的锺给新生BDF1鼠尾静脉注射5 氣尿味捉（F.HofTman-I^aRocheCo，Rase丨，Switzer丨and); 导致原始多潜能的造血祖细胞的募集。4d后，从3~5 只小飆收集脾细胞，用a-MEM培养液悬浮。2.4X10⁶ 个脾细胞被种植在35mrri直径的非组织培养皿内，皿内 含有 1.2% 甲基纤维素（1 500cP，lcP= mPa.s.AJdrich Chemical Co.，Milwankee)，30 % FBS, 1% 去离子牛血淸白 蛋白，0.1mM 巯基乙醉，50U/mL IL-3,和   IL-6。将培养皿放在37X：的CQ孵育箱（5% C〇i-95% 空气）内。每天在倒置显微镜下观察。培养笫7d,在倒 置显微镜下，将未成熟和无分化迹象的原始集落用3//L (Eppendorf)微*移液管吸出，悬浮到含有5%FBS和 10U/mLGM - CSF 的 a - MEM 内。％ 孔培养板（Bio- Tec, Tokyojapan),每孔种植1 500个原始细胞，每孔加 人培养液 10(VL(含有 5%FBS 和 10U/mLGM-CSF>,

培养7d以上。此后，各种浓度的l,25(OH)₂D₃或PTH 被加人到培养细胞中，继续培养到预期时间；链后，细胞 进行TRAP活性染色，在倒置显微镜下计数含有3个以 上核的丁RAP阳性多核细胞（MNCs)。

没有基质细胞但存在l,25(OH)₂D₃或PTH，此培养 系统能够形成MNCs。此MNCs具有一苎OC特征，例 如:TRAP阳性、多核、降钙索作用时明显收缩。OC分化 早期阶段PTH受体表达在GM - CSF支持的原始细胞 上；并且在堉养中期可査到1,25(OH)₂Dj受体。在分化 为OC样细胞同时，这些受体的水平减低，而降钙索受体 水平增高。m要的是，当和剥离的有活力的胚胎颅骨 (OC前体细胞还没产生）共同培养或和不能产生OC前 体细胞的死骨共同培养时GM - CSF支持的造血原始细 胞能吸收骨。当不存在骨基质细胞情况下，牙本质片上 培养的原始细胞，即使存在GM -CSF和l,25(OH>₂D₃, 这些细胞也不能分化为功能性OC;甚至不能存活。怛 是，克隆的MC3T3-G2/PA6基质细胞能支持原始细胞 分化为具有吸收牙本质活性的OC样细胞。上述情况表 明，在塑料盘h从造血原始细胞形成的TRAP阳性 MNCs似乎并不代表全部G分化的OC样细胞^[<1。

用FACS(荧光激活分类）流式细胞仪将造血原始细 胞群分离出来，进行培养，发现造血原始细胞来源于在 1,25(OH)₂Dj作用下能分化为OC样TRAP阳性MNCs 的单一细胞。

在此培养系统中，丨GF -丨，肝细胞生长因子，和 BMP-2支持原始细胞的存活，并强化1,25(OH)₂Dj诱 导的OC样细胞形成，说明了这些因子在OC生成中的一 种直接作用。此外，转化生长因子TGF-p和PGE2可直 接抑制OC形成₃关于基质细胞在OC生成中的作用，未 分化的成骨细胞抑制OC的形成，而完全分化的成骨细 胞和骨细胞刺激OC的形成。因此，此培养系统有益于 阐述各种因子对OC生成的直接作用，和基质细胞在OC 形成中的关联性^[5]。

(三）脾细胞和成骨细胞或基质细胞的共同培养

骨中基质细胞是OC完全分化所必霈的细胞。OC 形成发生在基质细胞的邻接区域。此外，造血原始细胞 来源的OC不能吸收骨，除非同时存在基质细胞。为了 解OC和基质细胞间的相互作用，建立了骨髄细胞和成 骨细胞共同培养系统^[6]。因为骨tt细胞群也含有各种基 质细胞可能与OC生成相关，为此选择脾细胞作为一种 含有OC前体细胞的细胞群落。下面描述脾细胞与来自 颅骨的成骨细胞的共同培养系统。

从新生鼠（1〜2d)无餡条件下取出颅骨，然后将大约 50 个领骨，用 10mL 含 0.1 %胶原:酶（Wako Pure Chemical Co. .Osaka, Japan)和 0• 2% dispase 的 PBS 在 37t：水摇 床内处理。收集从颅骨释放出的细胞，汇集到一起。此 消化过程重复5次。收集第2到第5次消化的细胞，离 心冲洗（centrifugation)，悬于含 10% FBS 的 a - MEM 液

中.以5X10⁵个细胞的初始密度种于肓径100mm培养 板中。直到培养细胞长满，然后用0.02%胰酶和0.01% EDTA离散细胞。离散的成骨样基质细胞可在-70T：下 冻存.有效期一个月。

在含10%FBS的a-MEM培养液内从6〜9天龄小 鼠制备脾细胞悬液。计数活脾细胞的数H。以每孔5X 10⁵个细胞密度与成骨样基质细胞（1 x 1〇⁴ ~2x 1〇⁴细 胞/孔）同时种于24孔培养板中，培养液为含各种因子的 10%FBS的a - MEM。在37X：湿润的C〇2孵育箱中 (5%(：〇2_95%空气）培养6天。每3天换液一次。然 后对细胞染色进行TRAP活性检测。

脾细胞单独培养时不能形成TRAP阳件MNCs,甚 至存在l，25(OH)₂I)₃的情况下，也不能形成。这个培养 系统在l,25(OH)₂D₃、PTH、PGE2和其它刺激因子的诱 导下OC可大M生成。继发的成#细胞样基质细胞可被 克降的基质细胞代特如ST2，MC3T3-G2/PA6或KS4, 以支持OC的形成。脾细胞的制备比用5氟尿嘧啶处理 M募集造血细胞容易得多。尽讶OC不能从单独培养的 脾细胞产生，这种共同培养系统对于阐述OC与基质细 胞的相互作用是很有用的

二、牙本质片上混合骨细胞培养形成（OC Generating osteoclast from mixed bone cells cul­tured on dentin slipe)

1992年建立了在牙本质片上培养混合骨细胞的方 法，以评估新形成OC骨吸收活性。破骨细胞样细胞 是在牙本质片上而不是在塑料片上产生的，新形成的细 胞比在塑料片上的细胞与体内真破骨细胞更相似。下面 就叙述这种方法。

预先用金刚锯（150_Mm thick)制备牙本质片，牙本质 片被凿成直径6mm圃形，超卢淸洗，75%酒梢灭菌。用 a-MEM冲洗后，放人96孔培养板.每孔放一片。然后 从丨0~13d大小的丨CR鼠的股骨制备混合细胞。在冰上 去除附者的软组织，用剪刀剪碎，在10mL含有5%FBS 的a-MEM中放SlOmin。用试管榉搅动0.5min,然后 静止2~3min，让大片沉淀。沉淀后，收集细胞，确定活 细胞数。离心后，细胞进行TRAP染色。这种细胞悬液 作为鼠混合骨细胞。为评价各种因子对已存在破骨细胞 骨吸收的剌激作用，将骨混合细胞（1 X丨〇⁵细胞）放置在 含一个牙本质片的小孔中进行培养，培养液为含5%FBS 的在 37X：的 CQ 孵育箱（5% C〇2 -95%air) 中孵育2h_a TKAP阳性细胞在孵育2h后附着在牙本质 片上。用含有5%FBS的a-MEM冲掉未附着细胞，将 含有因子的新鲜培养液加人到细胞中，继续孵痒2〜4d。 要评估抑制因子对已存在破骨细胞的骨吸收作用，大a 混合骨细胞(3X10⁵细胞/孔）加人到每个牙本质片上以 增加对照组的陷窝数；细胞培养同上，每2d换液1次。

耍检测新产生破骨细胞的#吸收，应该每个牙本质 片上加人混合细胞（1><1〇⁵细胞），在5%卩《5的〇-^^[^ 培养液中培养6d。培养Id后，TRAP阳性OC数目逐渐减少，培养第6d时毎牙本质片卜.OC数少于10个，预先 存在于混合细胞中的OC已降解。然后，在确定預先存 在OC消失后，在含5% FBS的a - MEM中加人各种浓 度因子，分别加人培养孔中继续培养。培养恰当时期，进 行TRAP染色，计数TRAP阳性多核细胞，然后用橡皮刮 从牙本质片上刮除细胞，在％孔板t用酸性苏木精染色 吸收陷窝。另外，分离混合骨细胞后，可以将细胞冻存 备用。

因为大多数已存在的OC被冷冻杀死，可免去以降 解预存OC为目的预培养；此外，可以用同样储存制备的 细胞群检测各种因子的作用。贮存的细胞融化后，加入 到含牙本质片的小孔中，加人含5% FBS的a- MEM培 养液，培养3d。用图像分析仪检测OC骨吸收陷窝的总 面积。更便利的楚，将一个网眼安在倒S显微镜的目镜 上，计数覆盖骨片陷窝每平方面积的网眼数。因此，网眼 数目代表了新形成OC骨吸收面积。

因为这种培养含有大*骨单质细胞，因子对OC产 生的作用可能来自因子对OC的茛接作用，和/或通过非 OC细胞间接起作用。这个检测系统有几个优点，能确定 OC产生，不潘要在OC形成后转到牙本质片上，而是在 同一牙本质片上检测骨吸收活性;OC骨吸收活性很容易 測到，并且比其它系统有更大的敏感性；从丨0只小鼠获 得的细胞数足以供300〜400个牙本质片的OC培养，并 且因为OC是在牙本质片上而不M在塑料片上形成。可 以消除人工产物对OC形成起作用的可能性。因此，这 种方法适干筛选对OC形成和活性起作用的各种药物和 因子。

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