成都华西华科研究所研发生产定量CT QCT骨密度体模软件分析系统

成纤维细胞生长因子与QCT骨密度体模软件检测方法

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FG- F_S),是20世纪70年代发现的生长因子。早期研究使用 的成纤维细胞生长因子（FGFs)主要来自牛脑和脑垂体 的提取液，是大约丨50个氨基酸结构的酸性或碱性成纤 维细胞生长因子（aFGF:FGFl或bFGF:FGF2)’"。后 来，分离癌基因产物的细胞增飱因子与上述FGFs结构 类似，也被划分在FGFs家族^[21。本家族成员由23个不 同的基因编码，各基因产物的结构和生物活性有很多相 似之处。在各组织中，FGFs以旁分泌/fi分泌方式调节 细胞的代谢和活性，它们都能与肝素进行高亲和性结合， 并与相应受体结合发挥生物学作用_n —般，除了促迸细 胞生长和诱导细胞有丝分裂外，还可促进血管生成和造 血干细胞的发育。另外，对伤口愈合、组织修复和细胞的 转型与组织形态生成也有促进作用^;31。

(一）FGFs家族结构的发现和鉴定 FGFs作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程 中起重要作用^l41。FGFs是由约150〜200氨基酸组成的 多肽，相互之间的氨基酸序列有20%〜50%是相同的。 其中心区域有大约120个袄基酸卬列存在商度的间源性 (30%〜70%)。利用该区域的同源性，以人、小鼠或大鼠 cDNA和基因组DNA为模板、采用同源序列PCR法进行 新FGFs基因检测。当然，还可以采用T7噬菌体cDNA &示法鉴定新FGFs。FGFs受体（FGFRs)是典甩的膜结 合酪氨酸激賂甩受体。将FGFRs的胞外结构域在杆状 病毐群（bacubvirus)农达株表达，制成東组的细胞外结构 域（可溶性FGF受体）。进而利用可溶性FGFRs与配体 结合的特性，通过T7哗歯体cDNA显示法对年补cDNA 文库进行筛选。

通过同源序列PCR法，已经发现了 6种新的FGFs 基 W (FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21)。 虽然T7噬曲体cDNA M示法能获得较多的阳性克隆，但 不能确认是新发现的FGFs。随者人类基闪组结构的解 析及其DNA数据库被公开，通过基因检索进而乂发现3

种新的 FGFs 基因（FGF19、FGF22、FGF23),并发现 FG- F22mRNA选择性表达于皮肤毛囊的内毛根鞘。加上在 探索视网胰特异性表达基因的过程中所发现的4种新的 FGFs 基因（即 FGF11、FGH2、FGF13 和 FGF14),以及 McWhirter等在探索嵌合体同源结构域癌蛋白（chimeric homcodomain oncoprotein) E2APbxl 下游目标过程中发现 的FGF15,迄今共鉴定出23种人或鼠FGFs^[s]。徂是人 FGF15和小鼠FGF19尚未被证实。人FGF19与小鼠 FGF15显示很高的同源性（约50%)，且这两种基因都跟 FGF3、FGF4基因的染色体邻接，由此推断人FGF19是 小鼠FGF15的相同体。由于人与小鼠其他FGFs结构之 间的同源性达90%以上，因而除非FGH5和FGF19在 进化过程中意外地发生大的变异，否则两者将伴随着进 化过程而逐渐消失。

(二）FGFs家族成员和基因定位

图7 - 16显示FGFs家族的系统进化树及人类21种 FGFs的基W定位。在人类的FGFs中，能细分出FGF7、 FGF10、FGF22 和 FGF9、FGF16、FGF20 等许多亚科 (subfamily)。FGFs亚科与各染色体定位之间无明显的 相关性，人类FGFs基因多数散在分布于全基因组中。 但也有一些FGFs基W在基因组上形成群落，如FGF3、 FGF4和FGF19位于染色体llql3,FGF6、FGF23位于染 色体丨3pl3,而FGF17、FGF20则位丁染色体8p21p22相 互邻接位置上。由此推断FGFs基因家族是在进化、复 制和M位等茇杂过程中形成的^[61。人类FGFs基因的翮 译区域多数由3个基因构成相似的外显子（exon)构成。 但在FGF11〜14的翮译区域是由5个外显子构成的， FGF_S基因翮译区域的大小约5〜100kb。此外，部分FG- Fs可通过机制不淸的选抒性剪接（alternative splicing)形 成FGFs亚型。FGFs可以分为儿个亚组，FGF10和 FGF7同属于角朊细胞生长因子（KGF)组。除了 FGF15 外，以22种人类FGFs氨基酸序列的中心区域为基础制 成以上进化系统树（FGF15使用小鼠的氨基酸序列）。

多数 FGFs(FGF3 ~8、10、15、17~ 19、21 〜23> 的 N 末端具有典型的信号序列分泌蛋白。然而FGH9、 FGF16和FGF20虽然没有明确的信号序列却能高效地 分泌到细胞外。FGF1和FGF2也缺乏信号序列和正常 的分泌途径，却能出现在胞外基质，推测两者可能来自受 伤的细胞，或者通过与内质网卨尔基体通路不同的细胞 脱颗粒机制进行释放。此外，FGF11〜14没有信号序列， 认为这些FGFs被储留在胞内。FGFs不仅存在于脊椎动 物体内，也存在于无脊椎动物体内。通过基因组的解读， 在果蝇和C.elegans分别找到1种FGF(branchless>和2种 FGFs(egll7 和丨et756),斑马鱼（zc - brafish)存 4 种 FGFs (FGF3、8、17、丨8),爪蟾（xenopus)则有 6 种 F(iFs[(FGF

以22种人FGFs衩基酸序列的中心区域为基础制成该进 化系统树（FGF15使用小鼠的氨基酸序列）。

• FGF10(KGF2)-^ 5pl2-pl3

•FGF7      ► 15ql5-q21.11

——► 19pl3.3

FGF22 _ FCF3 - FCF5 _ 1-FGFI6 LFGF9 . -FGF20 FGF1 ■

llql3

4q21

_► 13qll-ql2 -► 8p21.3-p22 ♦ 5q31 -► 4q26-q26

FGF2(bFGF)

•FGF12(FHF1)+ _3q28 -FGF14(FHF4)+ 13q34 FGF13(FHF2)-^ Xq26 FGF11(FHF3)-*- ¹⁷P³¹-

FGFs-

[

FGF4 -

FGF6 ~

FGF21

FGF23

FGF19

FGF15

FCF17

FCF8 ■

FGF18

.Ilql3.3

•        12pl3

> 19ql3.1-qter

•        12pl3.3

•        llql3.1

图7-16 FGFs家族进化树及其基因定位

(三）FGF受体的结构和功能（图7-丨7)

FGF受体（FGFR)是一条具有酪软酸激酶活性的多 肽链，包括4种密切相关的成员，它们的氨基酸组成和序 列相对保守.功能相近，参与介导细胞的生长、分化、迁 移、存活和一些病理过程，如血ff生成、创伤愈合等。4 种FGFK因其对各种配体的亲和力和组织分布不同而不 同。FGFRI-3在体内是广泛分布的，而FGFR4目前认 为只在发育早期大M表达，而且主要分布在视网膜和肾 脏。扦有报道说存在笫5种FGFR，甫含半眺氨酸，能结 合FGF丨-4,但其特异性配体和功能均不淸楚。后发现 一种FGFK异构体与这种FGFR有95%的氨基酸相同， 它的特异配体为选择家（E-selectin)。还冇一些异构体 被研究过，如FGFR样胚胎激酶（FREK)存在于早期胚 胎中，随分化而迅速减少，自然配体不淸楚。

完整的PGFR由三部分组成:胞外部分、穿膜部分和胞 内部分。胞外部分由3个丨g样结构域(DI、DZ、D3)及其间的 连接部分构成。其中丨)丨一DZ之间有一段由近30个谷氨酸 和天冬氨酸构成的氨基酸序列，称为酸盒(acid box),以及一 个三氣基酸序列（HAV ( histidine - alanine - valine)组软酸- 丙氨酸-缬氨酸），相似序列存在于N - CAM丄-CAM、N - Cadherin中，可能与细胞间连接有关。穿膜部分为螓旋形结 构，可能会缺失，形成分泌型FGFR,分泌型FGFR也具有与 PGF结合的能力。胞内部分主要由一分隔开的具有酩氨酸 激酶活性的结构域构成(TK1和TK2)。

FGFR1

Crouson and PfeifTer Apert

lg-I A U-D Ig-ffl

NHj

FCFR2

Muenk^

-StcT«nson

jAck»on-Weise

SP 1«-I A Ig-n Ig-B

NH,

aHHCOOH

Crouton wi ni|gicanA

ith «c«ntbo»is

FGFR3

UnclaMified

图7-17 FGF受体的结构和功能

(a)示四种受体FGF中3种发t变异译致颅Sf早闭。狍外K的EGF受体包含3种免疫球蛋fj样的环< I ,1] and (H)、一个W号肽（SP)和齩 性金了 (A>。《衩酸*«区被分成2个《K,TK丨和TK2。受体通ii时祺1<锘合到细狍明上。七种續琏早闭保合征是由于小㈣的突变位 *造成的。

FGF*过毓酸aid多猜结合判受体上•引起受体的二*化和G珙酸化作用。此R1M示了下游R标蛋白的《酸化触发机袖。Mitogen- Activated Protein Kinase

FGFR的多样件：4种FGFR分别由四种不同的FG- FR基因编码，每种基因都可能发生不同的拼接，产生多 种异构体主要的拼接方式有3种：缺失DI、缺失DI 和酸盒以及D3近膜侧氨基酸序列的多样拼接。其中D3 的多样拼接是决定FGFR特异性的主要因素。以FG- FRZ为例，现已发现至少22个外显子，根据D3的拼接 有3种主要的异构体:3a、3b、3C,这3种异构体分别由不 同的外显子编码。其中3a缺失穿膜部分或胞内部分，称 为分泌型FGFR2。而3b和3C则为FGFR2的主要形 式。FGFR23b是由第9个外M子参与拼接成的，又称角 化细胞生长因子（KGFR),特异识别FGF7(又称KGF：〉。 FGFR3c则是由第10个外M子参与拼接成的，又称细菌 表达激酶（BEK)。FGFR4与其他三种FGFR有所不同， 还没有发现它有D3的多样性拼接，但有人在肖肠道卜.皮 细胞中鉴定出了缺失了穿膜部分的可溶性FGFR4。除 上述的拼接区域（DI、酸盒、丨)3的近膜侧）外，多为保守区 域，其中有些对于维持FGFR正常结构和功能十分重要。 如果当中呆些氨基酸发生改变，将导致FGFR功能改变 或丧失，产生疾病。如FGFRZ的D2-D3连接部的253 位脯氨酸变成精氨酸，将导致八Pen综合征（阿佩尔综合 征)〇

细胞分泌FGF有两种机制：①内质网/尚尔基体依 赖性分泌途径，以此途径分泌的有FGF - 3- FGF- 9、 FGF-10-FGF-23_;②内质网/高尔基体非依赖性分泌 (主要为 FGF - 1 和 FGF-2)途径。FGF - 1 和 FGF-2 分布于细胞腴表面或细胞外基质屮，不含疏水性信号肽 序列。

(四）FGF受体信号传导

FGFR与配体的识别包括；FGFR与FGF之间的识 别和准二聚体（quasi-dyad)形成^[81。各种FGFR对不同 的FGF有不同的亲和力。通过对FGH - FGFR丨和 FGF2- FGFR2晶体结构的研究，发现二者的识别部位主 要发生在FGF与FGFR的D2、D2-D3连接部和D3。其 中FGF-D2和FGF-(D2-D3)之间的作用在4种FG- FR和丨9种FGF是相对保守的。特异的识别发生在 FGF与D3之间。FGF-D2主要是通过疏水键作用，各 种FGF-FGFR之问很少有差别。FGF-([)2-D3)则以 氢键为主，不同的FGF相应部位氨基酸有较大差异，导 致形成氢键的能力不同.但与识别的特异性关系+大。 FGF- D3是各种FGFR和FGF的特异识别区域。以 FGFR丨和 FGFR2 为例，D3 依次有 A，A’，B，B’，C,C’， E,F,G9个片层结构，这些片启结构之间形成了五个环， 其中B’- C,C’-E, F-G三个环在空间上位于D3的 上半部，是勻FGF识别的部位。三个环当中，环B’ -C 在各种FGFR M高度保守的，而环C’ - E和环F - G则 是多样的。后两环在氨基酸序列中位于D3后半，正是 [)3基W多样拼接的结果。

两分子FGF- FGFR先与一分了•的HSPG形成异五 聚体，又称准二聚体。然后才能激活FGFK的胞内部分。 HSPG是-个山一分子硫酸乙酚肝素和一个蛋白核心构

成的蛋白聚糖。至于足先形成FGF - FGFR再结合 HSPG,还是同时进行目前还不淸楚，但已知没有HSPG 参与，FGFR无法激活。每种FGFR与不同的FGF形成 准二聚体时，HSPG的空间结构不尽相同。以FGF1- FGFR2的准二聚体为例，HSPG以氢键与两个FGF1 - FGFR2分别作用，达到连接两个FGFl- FGFR2的目 的。FGF2- FGFR1也有类似结构。准二聚体的稳定还 有其他一些因素，包括两个相对的FGFR的D2之间的作 用，以及FGF与其相对的FGFR的D2之间的作用等。

当形成准二聚体后，两个FGFR的胞内部分的酪氨 酸激酶活性区域互相之间自发磷酸化.激活其酪氨酸激 酶活性。然后通过多条胞内信号传递途径，激活粑基因， 发挥其功能^f91。以FGFR2为例，FGFR胞内部分相互自 发磷酸化后，产生一些磷酸化酪氨酸残基，多为某些蛍白 的结合位点。根据其对应的配体，这些位点主要有两类： 一类的配体为含Sre同源性结构域的蛋白，如磷脂酶Cy (PLCy),另一类的配体则为能够识别磷酸化酪氨酸的蛋 白，如 FGFR 底物 2( FGFR substrate 2.FRS2)和 SHC。 PLCy能水解磷脂酚肌醉（PIP2)，生成三碘酸肌醉UP3) 和二酰箪ft油（DAG),从而导致钙离子释放及激活蛋白 激酶C(PKC),引发下行多条信号传递途径。而FRS2和 SHC连于GKB2-SOS复合体后，经过一系列反应，最终 激活MAPK(激活有丝分裂的蛋白激，酶类）_w后者进入 核内，通过磷酸化H接激活转录因子，启动转录。FGFR1 也有类似机制。对f不同的细胞及FGFR而言，PLCy途 径传递的具体信号和由FRS2及SHC最终启动转录的蓽 因是不同的，这其中还冇许多未知内容有待研究。而现 在d发现一种新型的存在干人胎盘中的FGFR1,即FG- FR- 1L,缺失D2和丨)3,不能结合FRS2,但能激活 MAPK,可能是通过非经典途径完成的。

(五）FGF与骨发育

在肢体发育早期，FGFR1在全间充质都有表达，而 FGFR2仅限于表层，FGFR3则无表达到软骨形成 时，FGFR1仍有表达，FGFR3也首次被测出。FGFR2则 存在于浓集的间充质。当间充质细胞向成熟软骨细胞分 化时，FGFR 1和FGFR2仅限于软骨膜，FGFR3则在软# 细胞中高表达。随者软骨内骨化.FGFR3仍在静止和肥 大的软骨细胞中表达，但在软骨膜和骨膜中无表达"¹、 而后两者仍持续表达FGFR1和FGFK2。山此可推知 FGFR3在骨生长过程中有诋要作用，而FGFR】和FG- FR2则与骨形态改变相关。已知有四种肢体骨发育不全 的遗传疾病与FGFR3变异有关，从轻到重分别是：软骨 发育不全、季肋发育不全、TD丨、TD2。四种遗传疾病是由 于FGFR3的不同变异造成的，其中TDI是由于FGFR3 的多种变异引起的，而其他三种则是分别由FGFK3的一 种变异造成^h21。最近，另一种骨骼发疗异常SADDAN (严重软骨发育不全伴发疗迟缓和黑棘皮病）被发现由 FGFR3的一种特殊变异（Lys650Met)引起。FGFK丨和 FGFR2变异对肢体钟的影响与FGFK3变异相比并不十 分显著。FGFR2的变异Ser252Trp、Pro253Arg会导致

Apen综合征，其主要症状为远端肢体畸形，如并指（趾）。 FGFR2的其他一些变异会使D3和D2-D3连接部的改 变，导致Jackson - Weiss综合征和Pfeiffer综合征中的远 端肢体畸形。对FGFR2的两种主要异构体3b(FGFR) 和3c(BEK)的研究发现，FGFR所传递的信号与远端肢 体畸形密切相关。至于FGFR1的变异Pr_〇252_arg则会导 致Pfeiffer综合征的宽大拇指和巨大脚趾。对于远端肢 体而言，FGFR2的变异相对作用强，而且有多种变异，导 致多种症状，FGFR1变异的作用则温和且专一。成都华西华科研究所研发生产QCT定量CT骨密度体模软件分析系统  
网址:http:// www.qctqct.cn  
手机 : 13072875151传真 :028-65830598
市场部电话 :028-65830598 028-67708638  83190122
在线 QQ:110480527 联系人 : 王先生
邮箱:samwangcn@126.com
地址 : 成都市静康路536号