成都华西华科研究所分析基因敲除动物用于骨质疏松症模型与QCT骨密度软件体模检测

基因敲除动物用于 骨质疏松症模型 (Gene target animals applied in osteoporosis model)

基因功能大多从存在的突变器官中得到，突变基因 往往从生物学与形态学鉴定的表型中得到确证。建立突 变表型与分子之间的联系是特别困难并耗时的，依靠器 官已在此违立了许多方法，如温度敏感诱变酵母等。

大多数情况下基因克降后再表达纯化蛋白质，但是 对基因功能知之甚少，偶而吋从编码蛋白的牛物学性质、 表达模式或基因间的同源性中得到。弄淸楚编码蛋白功 能的方法是运用基因组学和带有灭活基因器官。突变表 型的评价可推断蛋白质的正常生理功能。这种方法成功运用于果蝇和线虫等低级生物。要得 到在特定位点自发突变的哺乳动物则很困难，自发突变 頻率低和生殖周期长使得研究史为困难。如采表达的蛋 白质限定在某一器官，蛋白质分泌为内分泌模式，切除器 官后可研究蛋白所的生理功能。切除甲状旁腺后引起低 血钙和甲状旁腺激素分泌减少，给低血钙动物施用甲状 旁腺激素后血钙恢复正常。甲状旁腺激素的功能可进一 步在体内外研究。但表达的蛋白质不限定在某一器官时 切除器官的研究方法便不适宜。甲状旁腺激素的研究方 法不能用于在胎儿和成年体内按时空表达蛋白的研究， 这拽局限使得建立新的方法尤为必要。

转基因技术的出现使克服以上困难成为可能，基因 功能研究不Ff限于自发突变的获得。转基因技术包括基 因敲入和基因敲除，基因敲人是指在合适启动子控制下 诱导基因表达，基因敲除让基因关闭而失去基因功能。 运用同源重组技术在小鼠基因组中引人突变基因而产生 突变小鼠。在转基因细胞中引人筛选标志^[|]和培养搡作 全能小鼠胚胎干细胞~使得筛选同源重组成为可能。然 后将打粑的胚胎干细胞注射到3〜5天的囊肝中，然后发 育成胚胎的各组织，包括生殖系统。得到嵌合体小鼠，基 因改变的表型可从动物特征中得出。

现在多数研究集中在无效基因突变，即蓽因敲除后 基因不再表达。将基因插入、缺失或突变而改变感兴趣 基因是发展趋势，组织特异的基W沉畎是较佳方式。改 变基因敲除的技术可使以上目标成为现实。

基因敲除的技术已成为常规，这节将讨论技术方法、 新策略、可能缺陷及基因敲除在骨生物学中的应用。

一、基因转染胚胎干细胞（Gene targeting in ES cells)

基因转染后进人特定位点，箪囚打靶是基于打耙栽 体与小鼠胚胎千细胞基因组的同源序列进行甫组。打靶 栽体包括两个筛选标志，一个为新苺素抗件基因，位于同

源序列一侧，另一个为单纯疱疹病毐胸苷激酶基因，位于 同源序列另一侧。两个正负筛选标志用来筛选同源重组 细胞，当打耙载体进入胚胎干细胞后，载体上的同源序列 与基W组的同源序列进行重组。带有新霉素抗性基因的 片段取代目的片段后基因即敲除或破坏。同源重组的序 列不带革纯疱疹病毒胸苷激酶基因而自由重组却带单纯 疱疹病毐胸苷激酶基因。

(一）   同基因克隆细胞的分离

构建的基因打靶载体需要分离纯化包括敲除基因序 列的小鼠基因克隆，基因组DNA应从用于基因敲除实验 的胚胎T•细胞基因库中分离.这样基因审组的概率高^t31。 打靶载体与目的序列的多态性将降低打靶效率，减少打 粑栽体与目的序列之间的非匹配序列将提麻打靶效年。 小鼠品系之间的多态性在基因位点间不同，通常内含子 多态性比外显子多态性频率高。常用的胚胎千细胞 CCE,D3,AB1.J1从细胞系129/Sv中得来。用这些细胞 实验时可用细胞系129/Sv基因组DNA,尽管在非同基因 中也可迸行基因敲除，但用同基因DNA往往逬同源重组 的关键

(二）  基因打靶载体

通常有两种载体用于胚胎干细胞的基因敲除，分置 换栽体和插人载体。用S换载体时要敲除的特定基因被 带标记的片段罝换，用插人载体时整个载体插人到目标 位点，这样在目标位点有两段同源序列。每种载体均冇 邦优点，州插人载体时打粑效率高，但出现目标基因的异 常转录与翻译^15]。这样产生无效突变的载体通常用置换 栽体。

设计打靶栽体时要考虑野生型位点同源片段的5’ 与3’两侧序列，两俩序列的长度是关键因岽，增加同源 序列长度将提高打粑效率^[6]。最保守的方式是获得与敲 除序列一侧N源的长3〜5kb的基因组序列，如果目标等 位基因可用Southern方法检测，同源片段外的DNA序列 可被用来设计探针。仔细选择要敲除的外M子已保证包 括全蛋白序列，使得基因的全部功能缺失。至于被标志 基因罝换的基因长度对打粑效率影响较小^17]。

打靶载体必须带有两个正负筛选标志已保证打靶细 胞的正确筛选，正筛选标志有两个功能，首先重要的是筛 选整合转染基因的胚胎干细胞，其次是被用于改变内在 序列，用置换栽体可置换基因，用插人栽体时可插人基 因。常用的正筛选标志新霉索抗性基W编码氨基塘磷基 转移酶，对抗生素G418产生抗性，位于同脒序列一侧，另 一个为单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，位于同源序列另一 側。氨基糖在哺乳动物细胞、酵母、真菌和细菡中可抑制 蛋白成的合成。碘酸甘油酸激酶的基因阑节序列用在打 靶载体中可保证打靶细胞的存活ⁱ⁸¹。尽符新霉素抗性基 因和单纯疱疹病毒潋酶基因包括多檷病毒基因被用于打 靶栽体屮，但这些标忐筛选同源取组细胞的效率低^:91。 其他不常用的正筛选标志有潮霉素抗性基因、氨基糖、次 黄嘌呤鸟嗦吟磷酸核糖基转移酶基因

单用新樽隶抗性基因不能区分同源歌组与自由重 组，为区分同源侑组与自由重组，打粑栽体要带有负筛选 标志，通常在打粑栽体末端加人单纯疱疹病毒胸苷激醃 基因，申纯疱疹病毐胸苷激酶基因在其启动子或多瘤病 毒基因启动子的控制下。表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶 对哺乳动物细胞无毐。加人鸟嘌呤类似物ganciclovir、鸟 嘧啶类似物FIAU,将产生毒件代谢物，导致DNA合成陣 碍细胞死亡。同源重组的序列不带单纯疱疹病#胸苷激 酶基因，加人鸟嘌呤类似物ganciclovir、鸟嘧啶类似物FI- AU后细胞存活，而自由重组却带单纯疱疹病毒胸苷激酶 基因，加人气嘌呤类似物ganciclovii•、岛嘧啶类似物FIAU 后细胞死亡。两个正负筛选将使得1%〜15%的双抗克 隆包含正确的打粑基因。

打靶栽体的另一要求是在电转移骱要有限制性酶切 位点，如Not I通常设计在同源序列的外側，

(三）   胚胎干细胞

胚胎干细胞来源于胚泡梢入子宮前的内细胞层，常 用的胚胎千细胞CCE,D3,AB1,J1从细胞系129/Sv中得 来，129/Sv小鼠的毛色为深浅环纹。胚胎干细胞具有全 能性，可发育成各组织，包括生殖系统。正确维持可发育 成生殖系统的胚胎千细胞要考虑几个影响因素。

胚胎干细胞要保持低传代，这样可保持整倍染色体， 延长培养与传代，非整倍染色体细胞增加而不能发含成 生殖系统。

胚胎T-细胞要保持在合适培养条件以维持其全能 性，首先细胞耍商密度以保证细胞快速幣齐生长，传代3 天后细胞要融合。其次细胞要牛长在灭活的滋养层细胞 上，提供维持其全能性的信号转导和粘附的基质层。第 三墒养体系中要加人分化抑制因子如白血病抑制因子 UF，LIF自身可抑制分化以维持胚胎干细胞的全能 性^hn，LIF与滋养层细胞可更好的维持胚胎干细胞的全 能性。第四在胰酶消化前2h要换液以提高细胞活力，传 代后让细胞悬浮以分散细胞防止细胞丛生。

(四）   滋养层

尽管很多细胞系可用于滋养层，但小鼠原代胚胎成 纤维细胞最常用。小鼠原代胚胎成纤维细胞来自13.5 天去除头和内脏的各系小鼠胚胎，当用G-418抗性的滋 养层时，小鼠谢代胚胎成纤维细胞应来自新霉素转基因 鼠或基因敲除小鼠。

小鼠原代胚胎成纤维细胞约有5代的增殖能力，这 种细胞需经常制备和冻存。在接种胚胎千细胞前，滋养 层细胞应停止分裂。可用30Gy y射线照射或10/zg/mL 的丝裂祗家处理。丨0 cm²的培养皿中加人2.5X 1〇•'个 胚胎成纤维细胞，培养2w细胞存活，通常只用丨W。

(五）   电击转染ES细胞

打靶载体通常电击转染人ES细胞，这种方法重复可 稃。将打靶软体线性化有助十提高打靶效率，打靶载体 DNA与ES细胞浞悬在HEPES缓冲液中，电击参数为 600V，25_PF。电击后的细胞接种在长满滋养层的培养皿中，36h后换成含筛选药物的培养液。

(六）   ES克隆的挑取与扩增

两个正负筛选标志用来筛选同源里组细胞，电击后 的细胞接种在长满滋养层的培奍皿中，36h后换成含 G4丨8( 200_;ig/mL)和FIAU(0.2fim)的筛选培养液，每天 换液一次。未转染细胞加人G418或自由重组却带单纯 疱疹病毐胸苷激酶基因细胞加人FIAU后细胞死亡。在 转染3〜4d可见细胞死亡，FIAU筛选持续5天，0418筛 选持续到细胞冻存。未分化的ES细胞克隆在7d时可 见，在8-9d时挑取克隆S于96孔板中，以后传人带有 滋养层的24孔板中。

(七）   ES细胞的冻存与鉴定

当细胞未融合时冻存ES细胞，必须防止KS细胞分 化。用20%的胎牛血淸和10%的二甲基亚枫冻存ES细 胞，每个克隆一分为二，一份冻存，一份培养后转移至24 孔板中扩增后提取DNA,尽管PCR技术可快速鉴定目的 克隆rfil无黹冻存非目的细胞，但PCR技术也有局限^;|21。 现在快速的DNA提取和大爾克隆的收集使得PCR鉴定 不可靠。引物必须检测其准确性和灵敏度，必须在正筛 选标记基因和打靶基因外侧基因两处设计引物。可靠的 DNA扩增限制在2kb之内¹打耙载体两侧序列长度的 限制使得PCR受到很大限制„

经常用Southern杂交技术来筛选同源重组细胞，因 打靶载体两侧序列长度不受限制和引物设计位点常有竞 争序列，Southern杂交技术比PCK技术史合适鉴定，尽管 Southern杂交技术费时费力。在打耙载体上设it•合适酶 切位点，经酶切后探针杂交，同源甫组基因将产生不同的 基因片段。将同源重组与野生M苺因相比较将可确证基 因打靶细胞。

经鉴定的阳性克降解冻后扩增，未融合时将细胞分 为7份，6分用做囊胚显微注射，1份扩增做鉴定。再次 鉴定用不同限制性酶酶切后用不同探针进行杂交，以确 保载体进人正确位点。自由重组盅在新霉素抗性基因区 设计探针用Somhern杂交技术鉴定。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
网址:http:// www.qctqct.cn  
手机 : 13072875151传真 :028-65830598
市场部电话 :028-65830598 028-67708638  83190122
在线 QQ:110480527 联系人 : 王先生
邮箱:samwangcn@126.com
地址 : 成都市静康路536号