成都华西华科研究所分析骨质疏松嵌合体基因打靶小鼠与QCT骨密度软件体模检测

嵌合体和基因打靶小鼠

当阳性克隆鉴定后，下一步将显微注射得到嵌合打靶 基因的囊胚，再将囊胚移植到假孕小》体内^tMi，以后小鼠 出生，因为ES细胞来源于小鼠129SW品系，带有褐色的 毛色基因对C57BU6J的黑色是显性的，因此可从出生小 鼠毛色上判断ES细胞是否整合。褐色毛色嵌合高低反应 了 ES细胞的嵌合程度。选抒褐色为主要毛色的商嵌合度 小鼠与C57B176J交配，若ES细胞整合入生飱系，则新生 小鼠多为褐色。由嵌合体交配产生的子代小鼠中半数褐 色小鼠应携带来源于中靶ES细胞的基因打靶等位基因。 由嵌合体交配产生的子代小鼠中，如突变为非致死性，则 野生沏、杂合型和突变沏的比例为25:50:25。

C57BL/6J雌W为囊胚供体小鼠.因为RS细胞来源 于小鼠129SvJ品系，可冇效形成嵌合体和生殖系整合。 此外从出生小鼠毛色上判断ES细胞是否整合。囊胚供体小鼠的选抒基于小鼠表型和生殖能力，CD - 1和 B6D2F1小鼠也可为囊胚供体小鼠。

实验需要购置价格昂贵的显微注射装罝和熟练操 作，学会分离ES细胞、显微注射和棺入囊胚，以及制作对 显微注射至关重要的持卵针和注射针需要几周或几月时 间。为避免以上困难产生了另一技术，当ES细胞长至八 胚体时，过夜培养形成囊胚，ES细胞幣合人生殖系^[m。 尽赀选择这一技术，从DNA克隆到突变小鼠出生仍m 12 - 14 月。

当整合生飱系小鼠出生后，要确定是否为突变型小 鼠，突变与非突变小鼠表型的差异有助于判断。同一遗 传背景小鼠可与杂合小鼠或嵌合体小鼠回交，但ES细胞 来源的129SvJ品系小鼠的生育能力差。回交需要很长 时间，得到同基因項小鼠需20代以上。

二、组织特异的基因打祀（Tissue ^- specific gene disruption)

标准的基因打靶是去除所有细胞的感兴趣基因，如 果该基因对发育有影响可能导致胚胎死亡，尽背这样也 口J以获得基因在发肾中的作用，但不能发现在胎儿和成 年中的生理功能。

如敲除PTHrP基因，纯合突变体在围产期死亡，杂 合体在出生后骨发育陣碍。纯合突变体在围产期死亡而 不能观察到出生后变化，理想的情况是只在造骨细胞中 敲除PTHrP基因，这样软骨细胞的增殖和分化可能停 止^[~，小鼠存活可研究PTHrP基因的丹生物学^117]。有 必要建立组织特异的基因打靶的技术方法。

1994年首次将Cre/bxP系统应用到基因打靶，建立 了条件基因打粑小鼠。Oe重组酶发现于P1噬菌体 它能特异地识别34bp部分回文的LoxP序列，并通过分 子间重组将相同方向的LoxP序列间的核苷酸序列有效 切除。通过同源重组将LoxP序列S于靶基因重要功能 两侧的内含子中，LoxP不影响靶基因的转录和翻译，因 此所获得的是表型完全正常的条件基因打靶小鼠（fbxed 小鼠）。这种条件基因打靶小鼠与组织或细胞特异性表 达Cre解的转基因小鼠杂交后，可获得组织特异性基因 敲除小鼠，Cre/bxP位点依糗的重组便会发生在表达Cre 酶的细胞中并导致该特定细胞中靶基因被去除，其他细 胞或组织由于Cre不表达，耙基因仍有功能。

基因打靶栽体有3个LoxP位点，Cre重组酶介导到 的重组可发生在任意两个bxP分子之间，因此在Cre重 组《作用下3个LoxP位点间可能发生3种重组结果：笫 一种重组将选择标志基因和靶基因片段同时删除；第二 种审组结果导致标志基因新霉索抗性基因丢失，刺下粑 基因和其吶锎的LoxP位点。第三种重组结果导致靶基 因删除而只留下筛选标志新霉素抗性基因和单纯疱疹病 毒胸苷激酶基因片段^h91，在G418和F1AU的筛选下将 死亡。笫二种重组鉴定棺入胚囊后产生嵌合体小鼠，冉 与C57BL/6J交R而得到条件基因打耙小鼠。

组织特异启动子控制下转Cr_C醃小鼠与条件基因打靶小馱交配将得到在目标基因区只有Cre酶的小敵，开 始时Cre/bxP系统应用到基因打靶导致目的基因的不完 全删除，这可用修饰的Cre酶避免^[M1。如问题仍然存在， 无效突变的杂合体小鼠再交配得到含等位基因含无效突 变和条件基因打靶位点的小鼠,Cre酶只切除条件基因打 靶位点即可。这种策略使得目的基因的完全删除而其它 组织含有正常基因而表达相关蛋白质。

三、位点特异突变和置换（Site-directed mu- tagenesis and gene transplacement)

基因敲除的另一策略是稍微改变基因而不影响其余 基因，这种策略在体可研究基因的结构与功能，这种策略 也可用非同源基因置换目标基因，这种方法即基因敲人的研究方法^[~。

打把栽体包括neo- ntr- hsv- tk序列，经G418筛 选后目标克隆用Southern杂交鉴定，然后再扩增。一旦 含neor-ntr-hsv-tk序列的细胞建立后，可用置换软体 引人一系列改变而突变、缺失基因。置换载体不含筛选 标志。目标基因序列可在同源臂之间插人基因，F丨AU可 筛选丢失筛选标志的胚胎千细胞。基因敲人的另一好处 是筛选标志从基因序列中删除而不影响分子识别或基因 的表达与功能。

基因打靶的主要优点是在充整动物体上研究基因的 功能，这种策略也有局限，如基因改变发生在完整动物体 上可有多种影响，导致表型解释困难，敲除必须基因后导 致胚胎死亡而无法后续研究，以及没有明显表型的突变等。

设计合适打靶载体，不仅产生感兴®基因的无效突 变，也可引入小突变或功能获得性突变或突变蛋白。改 变启动子序列或其它关键序列也是可能的。

基因敲除小鼠使我们明白了影响骨骼发育的影响因 素，编码同源倉基因的转录因子对骨形成十分关键，敲除 这些基因导致骨的缺失和转化，敲除hoxa-2基因将导 致前臂和后臂骨的发育敲除PTHrP和PTH/PTHrP 受体发现了骨的生长特点，敲除PTHrP基因使软骨细胞 凋亡、增生抑制和未成熟分化，导致骨软骨发育不良^[231。 敲除PTH/PTHrP受体也有同样表现，结果提示这一受 体不仅结合PTH也结合PTHrP,PTHrP和N端受体在 正常软骨内骨的发宵中有重要作用。对骨结构和功能的 关键因子也被发现，敲除c-_src因多核破骨细胞缺少再 吸收能力而导致骨石化症敲除c-fos破骨细胞不分 化而引起骨石化症^125],敲除W,V，V1甩胶原发现了这些 蛋白质在骨和软骨形成中的作用。

将来会对更多基因打耙小鼠迸行分析，对哺育动物 骨形成、骨生长分化、骨结构和骨转化的研究将有重要 意义。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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