肿瘤坏死因子与QCT骨密度体模软件检测方法
成都华西华科研究所分析肿瘤坏死因子与QCT骨密度体模软件检测方法
肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF)是 1975 年由Carswell发现并命名，是一种主要由单核巨噬细胞 系统活性细胞分泌的多活性蛋白质细胞因子。它不但参 与机体的免疫调节，在许多重要的生理、病理活动中起到 积极的调节作用，而且对#代谢的影响具冇非常M著的 意义U1。随着分子生物学、箪因诊断学及免疫学的发展， 人们对TNF的基因结构、功能、生物学特性以及与疾病 的相关性进行了深入的研究，是近年来研究较深人，应用 较广泛的新型细胞因子[2]。TNF在骨质疏松发病中所 表现的作用，最近亦引起人们的极大关注，成为细胞因子 研究的热点之一。
(一）TNF的生物学特性
TNF是一个分子家族，其家族成员的生物学特性相 类似，在结构上存在笤不同程度的相关性。TNF根据来 源可分为3种：由活化单核巨噬细胞（M4>)产生的称为 TNF-a,乂称恶液质素；由活化T淋巴细胞产生的称为 TNF-p,亦称淋巴毐索；由NK细胞产生的NK细胞# 性因子称为TNF-Y,其中TNF-a与骨质疏松关系密 切。各种外来剌激如内毒素脂多糖（LPS)、肠毐家.霉菌 抗原、某些奇生虫的溶解物、病毒颖粒等.均可以引起 TNF的表达与释放。基础实验研究发现大、小鼠和家兔 的M
人TNF分子质M约170ku,由157个氨基酸组成。 pH在6. 0〜8. 0之间稳定，56t：处理lh不失活，70t：处 理1小时则失活。重组人TNF (rhTNF)分子质M为17ku,含157个氨箪酸，pH在5〜9之间，60t：处理30min 仍稳定，70X：处理30min则失活。rhTNFa在体内外邢M 示出其与自然TNF-a相类似的活性。重组人淋巴毒素 (rhLT)即rhTNF-p的分子质量为25ku,含171个氰基 酸，它与rhTNF-a的氨蓽酸顺序有26%是一致的。血 浆TNF的半衰期只有10.5—17min。TNF基因位于第 六对染色体短背上，与主要组织相容性基因紧密联锁，分 子质量随动物种系不同而异。TNF的蛋白质结构有多 种形式，有二聚体、三聚体、五聚体，有生物活性的是三聚 体。不同种属来源的TNF在蛋白质组成的一级结构上 具有极高的同源性，因此在生物学作用方面无明显的种 埔特异性。通过对TNF分子一级结构的研究表明，C末 端在TNF的生物学活性中起决定性作用。由于C末端 参与TNF高级结构的构成，只要去除1个氨基酸就可使 TNF丧失生物学活性:5]。而N未端的变化范围较大，适 当改变其长度并不影响其生物学活性，但N末端与TNF 对受体的结合能力密切相关，可能为与受体结合的部位。 TNF受体存在于多种细胞表面，不同细胞表面TNF受 体的数目和亲和力有很大差异。
TNF基因多态性
1. 单核苷酸多态性 Wilson等采用聚合酶链反应 -单链构像多态性（PCR-SSCP)技木对TNFa基因启动 子区域进行分析，发现- 308位点（相对于转录起始位 点)存在G/A等位基因多态性。其中G等位基因頻率较 高，为野生型；A等位基因频率较低，为突变型。进一步 研究表明该位点基因多态性与HLA某些单倍铟存在连 锁不平衡，其中A等位基因与HLA-A1、B8、DR3单倍 型显著相关。Endo等应用聚合酶链反应-序列特异性 寡核苷酸探针（PCK-SSOP)技术对46例早发性牙周病 患者和104例健康对照者TNFa基因5’端进行分析，共 检测到5种单核苷酸多态性：-1031(T/C)，- 863(C/A), -857(C/T), -308(G/A)和-238(G/A),且这些多态性 等位基因和基因型分布频串在两组人群中差异无显著 性。此外，TNF-a基因单核苷酸多态性还包括-11% (C/T),-1125(G/C), - 572(A/C), -316(G/A), - 163 (G/A), + 70(G/A)。目前，有关TNF0基因咿核苷酸荇 换多态性的研究，主要是TNFp基因内含子1处+ 252位 点的G-A待换，而导致Ncol酶识别序列的改变:6 7]。
2. 微卫星多态性研究表明，TNF基因位点存在5 种微卫里多态性，分别定义为TNFa、TNFb、TNFc、TNFd 和 TNFe，其中 TNFa 为（GT) n 重复，TNFb 为（GA) n 复,两者紧密相连，位于TNFp基因下游约3.5kb处； TNFc为（GA)n東复，位于TNFP基因内含子Ikb内； 丁NFd和TNFe均为（GA)n重复，位于丁NFa基因上游 约8〜10kb处。这5种微卫星多态性分别含有13、7、2、 6和3种等位基因，可产生3276种不同单倍塑，是研究 TNFa和TNF0与疾病关系的茧要分子遗传工Aw
(三） 膜TNF的性质及生物学特性
在细胞毒性试验研究中发现TNFa活性与激活单核细胞之胞浆膜相关，并证实了另一种形式的TNFa即膜 相关性TNFa之存在。进一步用TNF特异性抗体经流 式细胞仪，间接免疫荧光以及免疫电镜技术证实在巨噬 细胞、单核细胞、T淋巴细胞存在膜TNF。
膜TNF为一分子质S26ku的完整穿膜蛋白。其拥 有一段疏水区嵌于细胞膜脂双层，可能为分泌彻TNF之 前体蛋白，经胞外环境的某种蛋白梅作用而产生17ku之 分泌蚩白，也可能存在细胞本身的某种机制，如丨FN-7 作为剌激剂仅诱导膜TNF表达，而不分泌TNF,即仅诱 导TNF前体蛋白产生，却不诱导特异性蛋白梅。
腴TNF在体内的生物学意义可能冇：
1. 腴TNF与细胞成熟、激活相关 TNF的细胞膜 衣达部分依赖于细胞的成熟程度，1,25-二羟维生家D3 (D3),IFN-y,GM CSF(粒、单细胞集落刺激因子）能调 节单核细胞之成熟、激活，这些因子可增加人中核细胞株 U937细胞膜农达TNF而不影响TNF释放。非激活 U937细胞表达腴TNF为9±4%，D3,GM-CSF单独可 诱导膜TNF表达,48〜72h达高峰，阳性细胞为30%,而 IFN-Y作用更强，24h达高峰，并持续96h。若D3和 GM-CSF联合作用则冇助干LPS介导的TNF释放.提 示上淸屮TNF至少部分来源于膜TNF,可能足D3, GM-CSF共N始动某种特殊机制使细胞膜TNF脱落。 TPA和ionomycin在激活中核巨咮细胞同时促进膜TNF 的表达，而CsA和甲基泼尼松龙则抑制丁细胞表达 TNF。
2. 脱TNF参与H1V感染人T细胞诱导的多堯降B 细胞激活冇研究表明感染H1V的人CDT细胞在体外 明敁刺激B细胞合成免疫球蛋白，这种作用限于 TNF-a阳性T细胞，并为TNF-a和TNF-a受体的抗 体所抑制，是否膜TNF - a单独可激活B细胞或足膜 TNF-a和HIV相关信号共同激活B细胞还不淸楚，但 这种经膜TNF- a的异常途径至少可部分解释HIV感 染个体的高免疫球蛋白血症及其相关特征，提示膜 TNF-a在这类病人B细胞恶性肿瘤发展中具有一定的 作用。
3. 膜TNFa作为分泌TNFa之前体蛋白，其本身又 H有细胞奉活性推测TNF的生物合成和分泌不同于 一般的分泌蛋白，细胞先合成一 26kU之TNF前体穿膜 蛋d,经剪切脱落产生成熟的丨7kuTNF。在研究人苹核 细胞TNF产生及定位时发现大多数TNF释放前定位于 核旁器或商尔基体，TNF以26ku穿膜蛋白形式存在于 分泌器衮面，后名•脱顎粒时将TNF融于细胞膜衣面。 TNF前体多肽可能典有保护作用，以防TNF不恰当的 释放或细胞的自分泌刺激.活性TNF释放的调节在于其 前体的脱落、成熟，由于TNF多肽前体在不同种《较成 熟TNF更为保守，提示前体蛋白本身具有功能，如膜 TNF介导细胞接触杀伤活性，对TNF相对抵抗的K562 细胞也具有杀伤作用，具有圯广泛的靶细胞谱。总之，膜 TNF不同于分泌S TNF,膜TNF杀伤定位准确，属于天 然生物性防御，而分泌TNF却诱导多种副作用，与恶液
质疾病严重程度有关
(四）肿瘤坏死因子受体（TNFR)
1. TNFR分类及其分布 TNFR按分子质M大小 分为 55ku ( TNFR1 - P55> 和 75ku( TNFR2 - P75)两 种。两种受体均存在于肝、肾、肌肉等多种组织细胞和免 疫细胞表面，也存在于多种肿瘤细胞衣面。一个细胞表 面平均含有1000〜10000个受体，这决定笤TNF的作用 的广泛性和高效性。丁NFR - P55与TNFa的亲和力 (ku = 0.5Nm> 明 M高于 TNF0( ku = 0• lNm),TN- FR-P55被认为是TNFa的主要受体。由于TNFa作用 广泛，研究比较深人，因此，TNFR- P55倍受人们的关 注。
TNFR不仅存在于组织细胞膜t,在血和尿中也有 存在，称为可溶性TNFR(sTNFR)。sTNFR是膜TNFR 蛋白梅水解下来的胞外区片段。sTNFR根据其来源分 为 sTNFR - p55 和 sTNFR - P75。sTNFR 水解 T 来的 机制不太淸楚，有人认为要依赖于TNF的存在^ TNFR 在体内的半袞期不长，主要通过肾脏以TNFR-TNF复 合体的形式淸除。
2. TNFR的分子生物学特征人TNFK2P55基因 位于第12号染色体（12P13)上，其cDNA包含1. 3kb碱 基阅读框架，编码455个氨基酸多肽蛋白。其中有29个 氨苺酸信号肽，182个氨基酸胞外功能区，2丨个氨基酸 的跨膜功能区，223个胞内功能区。其中胞外功能区贪 冇24个4组富含6个保守半胱氨基酸的車:复结构域。 TNFR-P75基因位于第1号染色体（1P36)上，其cDNA 编码461软基酸，其中胞外区235个氨单酸，包括4个富 含半胱氨基酸的重复序列，2个N连接的糖基化位点。 跨膜区有28个亲水的氨基酸.膜内区含有丨75氨基酸。 由于TNFR-P55和TNFR-P75胞内区结构不同，因此 它们的信号传导方式及生物学效应也不一样（图7- 18)。
7-18 TNF受体及倍号传导途径
sTNFR为分子质敏30~50ku的糖蛋白，由一条多 肽链组成，南有半胱氨基酸和较多的葡萄糖胺，以及至少 3个N2连接的寡糖侧链。sTNFR-P55前20个袄基酸序列与腴TNFR2-P55的胞外区高度同源，其胞外区N 端20〜29个氨基酸序列与TNFR- P55完全相同，其羧 基端氨基酸序列（Lie-G丨u-Asn-COOH)与TNFK- P55第178〜180位完全相间。另外sTNFR- P”的粮体 氨基酸序列与TNFR-P55的胞外功能区非常接近。也 有文献证明sTNFR-p75氨基酸序列与TNFR-P75的 胞外功能区相似。sTNFR等电点为5. 5〜6. 1 ,对热和 蛋白水解酶敏感,37t：胰蛋白水解梅作用24h,活性下降 60 % ,耐酸碱及氧化反应。STNFR-P55与TNFa结合 能力大于TNFp，STNFR-P55在pH < 5. 0时，不能与 TNFa结合0 sTNFK-TNFa复合物对还原反应较敏感， 1. 25 %的巯基乙醉能使其有效分离[^3]。
(五）可溶性肿瘤坏死因子受体（sTNFR)对 TNF的调节作用及生物学恚义
sTNFR 分 sTNFRl(sTNFR-P55)和 sTNFR2 (sT- NFR-P75)两种，分别来源于相应膜受体的膜外段，可能 因某种酹解作用蛊接从腴上脱落，也可能为膜受体内吞 后经酶解作用再分泌出来。尽管sTNFR缺乏细胞内区 域，但同样能结合配体并影响其功能，在某些情况下sT- NFR具有抑制TNF的作用，在另外的情况下也可作为 TNF•栽体稳定TNF活性，甚至促进其发挥作用。sTN- FR已被用于败血症休克、关节炎、肾移棺、肺纤维化等疾 病的治疗中114]。
Engdmarm首先发现尿蛋白粗提物在体外具有对抗 TNF细胞毐的作用，继而纯化了 27ku蛋白，具有与 TNF-a和TNF-0特异结合的特性，称之为TNF结合 蛋白（TNF-BP),该蛋白可保护A9细胞免逍TNF#性 作用，并千扰TNF-o和TNF-p与细胞结合，但不影响 IL-l,IFN-7与相应受体结合。同期Seckinge也报道 了尿中TNF抑制因子（TNF-INH)的存在，TNF-丨NH 主要阻断TNF-a结合于U937细胞，对TNF-p作用 弱，而不影响其他细胞因子的细胞结合作用。TNF- INH不是单纯的栽体蛋白，它能将125丨-TNF-a从受 体解离，更说明了 TNF - INH对TNF具有生物活性作 用。sTNFRl和sTNFR2可完全独立置换标记TNF与 U937细胞的结合，但sTNFR2与TNF的亲和力较sTN- FR1低100多倍，可能为其变性之故，由此认为sTNFR 作为TNF活性的生理拮抗剂可抵抗TNF之有害活性， 当然，sTNFR也能抑制TNF«的肿檐坏死活性。另有报 道sTNFR也可稳定TNF活性，很可能通过防止冇活性 的TNF三聚体解离为无活性的单体。实验显示sTNFR 低浓度时具冇促进TNF诱导慢性B淋巴细胞白血病细 胞的生长作用，而高浓度时则抑制，无TNF时，sTNFR 无任何作用，TNF诱导正常人纤维母细胞生长作用也同 样受sTNFR影响。正常情况下，TNF以二聚体、三聚体 为活性形式，当sTNFR存在时，TNF高聚物的比例明显 减少，而TNF与sTNFR复合物仍具有细胞毐活性，提示 该复合物可解离出有活性的TNF,反映了 sTNFR对 TNF的稳定作用。TNF与sTNFR结合喊缓解离并稳定 于活性体的原因不明，推测蛋白质稳定是由于其诱导构
型的改变，类似底物与酶结合而诱导酶的构S发生变化 并促其稳定基于sTNFR的来源及其对TNF的影响，其在体内 可能的生物学作用冇：①sTNFR作为膜受体的淸除形式 之一，TNF、PMA负向调节TNFR的同时，sTNFR产生 增加，膜受体减少，使细胞对TNF的反应性下降，保护机 体抵抗TNF的病理损伤作用；②sTNFR本身的免疫调 节作用，一方面与膜受体竞争结合TNF,干扰TNF与相 应细胞结合；另一方面，sTNFR又具有稳定TNF之作 用，在循环中，sTNFR对TNF的稳定作用难以起效，但 在局限腔室内（如滑液腔、中耳、脑介液中）sTNFR可作 为缓冲介质，当TNF多时，可结合稳定之，而TNF减少 时，又可缓慢释放之，因而sTNFR成为生物活性TNF之 缓释库。③sTNFR丨与TNFa的亲和力明M大于TNFP, 而膜受体与TNFa、TNFp亲和力基本相同，说明TNFR 膜外区域的释放可致受体结合TNFa、TNFp相对亲和力 的改变，从另一方面调节TNF作用；④sTNFR本身具有 细胞因子样作用，似可溶性FccRII模拟IL-2作用， sTNFR通过膜26kuTNF发挥作用，26kuTNF存在于单 核细胞、激活的T细胞，可见不仅单核细胞能影响中性粒 细胞，中性粒细胞也能通过sTNFR影响单核细胞[^81。
(六）TNF与骨代谢
尽宵TNF-a和TNF-p分別由不同的基因编码， 但其生物活性相似，都可促进骨吸收，抑制骨基质胶原合 成。向动物注射TNF-a和TNF-0可诱发高钙血症， 但坷被降钙索阻滞。TNF-a也可上调成骨细胞骨保护 素（OPG)的表达。与RANKL—样，TNF_a对成骨细胞 的作用均是由NF-icB介导的。
骨髄基质细胞具有多向分化潜能，可分化为成骨细 胞、软骨细胞、脂肪细胞、内质细胞及肌细胞等。用 TNF - a干预小鼠骨髓基质细胞株（mouse bone〜stromal celUine- 1,MBA-1)后，OPGmRNA和蛋白质表达下调， 雌二醉可阻断TNF - a下调MBA - 1细胞OPGmRNA 和蛋白通的表达，其作用途径与NF-kB无关。
TNFa由成骨细胞合成。丨L-1、GM-CSF和脂多 糖等可促进成骨细胞合成TNF - 〇«,但PTH、1,25 - (OH)2〇3或降钙索无此作用。TNF的两类咽膜受体都 可转导TNF•信号，在多数情况下，两型受体是转导TNF 信号所必需的，但一些作用只需激活任一型受体即可。 此外，TNF-X可能与骨肿瘤有一定关系。破骨细胞生 成抑制因子（OCIF) / # 保护素（osteoprotegerin，OPG )是 一种新发现的以可溶性蛋白质形式存在的破骨细胞负性 调节因子，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，其配基 RANKL被证明是破骨细胞分化因子，〇PG可与其配基 结合，阴断其配基的信号下传而抑制破伢细胞的生成、活 化，其他骨吸收调节因子可能部分或全部通过调节OPG 生成而发挥作用。该因子的发现，为探讨骨质疏松的发 病机制及其顸防和治疗提出了新方向。
钟微环境中的TNF既可由破對细胞样细胞合成，也 可由成骨细胞产生。TNF在体内外都是强有力的骨吸收剌激因子，其影响骨代谢的作用通过多种途径完成。 TNF通过介导成骨细胞，刺激巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)、粒-巨细胞集落剌激因子（GM- CSF)、 IL-6的分泌，影响破骨细胞的增殖、分化、融合及成熟， 或直接剌激前破骨细胞增殖和分化，增强基质细胞中前 破骨源性细胞的活性来促进破骨细胞的形成及抑制破骨 细胞的凋亡；通过前列腺素PGEj诱导RANKL的表达并 降低OPG的表达，促进破骨细胞前体分化及成熟破讨细 胞的功能；TNFa对成熟破骨细胞的骨吸收功能也冇促 进作用，而且抑制成骨细胞碱性磯酸酶的生成及丨型胶 原的合成，抑制骨形成和钙化；同时，TNF可以剌激NO 的产生，而高浓度NO对成骨细胞系的增殖有抑制作用。 TNF也可通过转录因子NF-Kp介导抑制维生素D剌 激的骨钙素合成。调节bax/bcl2比值，抑制破骨细胞凋 亡，促迸成骨细胞凋亡。以上所有这些TNF的作用结果 是使破骨细胞贵及活性增强，骨吸收增加，成骨细胞减少 及#形成减少，导致背质琉松。
Roggia等:M>]认为雌激家缺乏的小鼠中，T细胞分泌 的TNF通过与TNF受体P55(表达于骨髄单核细胞表 面）的结合，能够加强RANKL诱导的破骨细胞形成6 Johnson等1证实人类TNF〇基因转染的中国田鼠细胞 可持续产生TNFa,并使裸鼠破骨细胞的骨吸收作用增 强，出现高钙血症。Ammarni等[2U报道将转基因高水平 表达可溶TNF受体（STNFR1 Fc lgG3)的小鼠和对照组 小鼠卵巢切除，12周后对照组小鼠骨ft减少，骨转换加 快，而转基因小鼠骨代谢无变化，说明高水平表达的ST- NFR1 Fc lgG3融合蛋白可中和TNF的生物学作用，防 治卵粱切除后的骨丢失，同时说明雌激素对TNF的释放 有抑制作用，雌激素降低或消失，导致单核细胞产生的 TNFa增多而致骨丢失，同时促使成骨细胞产生IL-6的 量增加，从而增强骨吸收。Kitazawa:22)在小鼠的研究表 明，切除卵巢可使骨髄细胞分泌的TNF增加，若体内给 予TNFbp( TNF结合蛋白，一种TNF的抑制剂 >,可明显 抑制卵巢切除后的骨吸收增强.减少骨铺内破钟细胞样 多&细胞的形成。有作者通过RT-PCR技术研究表 明：绝经后毋质疏松骨折妇女、止常绝经后妇女及绝经后 采用雌激素替代疗法妇女TNFa mRNA的表达分别为 63%、60%和10%,前两者明M高于后者。免疫组织化 学观察证实：TNFa在骨质疏松症的骨小梁及骨髄腔中 分布类似，主要分布在骨小梁周边的成骨细胞和骨髄基 质细胞，在胞浆中表达为强阳性，而骨基质中成熟骨细胞 表达阴性；成伢细胞染色明显深于骨髋基质细胞，推测 TNFa可能通过自分泌和旁分泌的形式作用于骨吸收和 骨形成之间的耦联a另有学者从统计学的角度研究了 TNFa阳性细胞与BM丨）的相关性，发现其二者呈负相 关，且随BMD降低，TNFa阳性细胞数迅速增多，表明 TNFa参与骨吸收，而正常靑年妇女血淸丁NFa水平与骨 密度无明显相关性。同时有学者报吿去势后动物血清和 伢组织中TNFa与血淸Ej亦呈高度负相关。雌激素对骨组织的作用，是通过调节骨髄细胞，骨细胞产生细胞因子，细胞因子调控#改建的过程而完成的。 TNFa对骨代谢的作用也受雌激素的调节，雌激素在基 因水平抑制成骨细胞TNFa的表达与释放。一方面雌激 素可直接抑制AP-丨依赖的转录；另一方面雌激素还可 通过调节c-Jim表达以及抑制c-jim末端瀲酶磷酸化 而抑制TNF-a基因的表达。在单核细胞，雌潋素抑制 AP-1介导的TNF«基因的表达作用，不同的受体（ERa 及ERP)其效应楚不一样的，雌激索与ER0的抑制效成远 大于与ERa结合的效应。雌激素对AP-1介导的基因 表达的作用是促进还是抑制需要根据细胞的类型及细胞 内伯号的转导方式而定。当妇女绝经后雌激索水平降低 时，TNFa的基因表达增加，体内TNF«水平升高，从而使 背吸收增加，溶骨所释放的产物激活巨嘸细胞产生更多 的细胞因子包括TNF,后者反过来增加和扩大溶骨的应 答[23’~。因此TNFa近年来被认为足病理条件下调节骨 吸收的重要因子，它与雌激索的关系更是研究的热点。
TNF生物性能广泛，在机体的免疫调节抗肿瘤作用 及#质疏松的发病中起单要作用。随着TNF基因工程 技术的发展，将会通过修饰TNF的分子结构，使其成为 既具有更特异的杀肿瘸细胞活性，又无副作用的蛋白因 子，在免疫调节及抗肿瘤方面发挥更大的作用，为TNF 治疗肿瘤开辟新的前景。同时TNF在骨质疏松发病机 理中的作用也日益突敁出来，通过基闶工程及分子生物 学手段，调整和改变TNF在机体中的表达和生物学行 为，必将为竹质疏松的治疗开辟新的途径。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统
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