成都华西华科研究所分析骨质疏松性骨折的细胞基因治疗与QCT骨密度软件体模检测

骨质疏松症及骨质疏 松性骨折的细胞和基因治疗 (Cell and gene therapy in osteopo­rosis and osteoporotic fracture)

人体骨骼有支持、运动、保护、造血及钙储存等多方 曲的功能。骨的吸收与形成贯穿于人的生命始终，是多 因素交互作用的结果，这些因索包括成骨细胞、破骨细 胞、激素和细胞因子等，最终达到骨结构的稳定和钙的系 统性平衡。生命早期，成骨活动及破骨活动间存在者激 妙的、活跃的合作，共间保证了骨吸收与形成间的平衡。 随t年龄的增长，以及女性绝经后雌激素的缺乏，破骨活 动增强或者没有明显改变，而成骨细胞的活动减弱，打破 了厣冇的平衡。骨质疏松正是由于骨吸收与形成间的失 衡所造成，也是机体老化的标志。

绝经后骨质疏松的发病与细胞因子改变的密切关系 已冇较多报告。雌激家在基因水平抑制白介素-1 (IL-丨）、肿瘤坏死因子-a(TNF-_a)的表达。当雌激索 水平降低时，丨L- 1、TNF- a的基因表达增加，体内 IL-l、TNF-a水平升高，促进破骨细胞的增殖、分化、融 合，使竹吸收增加，骨代谢偶联失衡，从而导致骨质疏松。 最近人们更进一步发现成骨类细胞和生长因子的变化与

干细胞外，#髓中还有一类间充质T•细胞(Mesenchymal stem cells.MS^)具有多向分化潜能,可以在一定条件下分化成为 骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱,皮肤等(图20 - 1)。

软骨细胞

骨餹间充质干细胞

脂肪细胞

成卄细胞    有•细*4

图20-1胥《间充质干细胞的分化增能

很多研究指出，MSCs的成骨潜力和数燉随年龄的增 长而下降。丨ppdito等发现椎体每106个骨髄单个核细 胞中，ALP染色阳性成纤维细胞集落形成单位（Fibroblasf colony forming unit, CFU - F)集落数 M 在 3 — 36 岁人为 66.2±9. 6个，而在41〜70岁人仅14. 7 ±2.6个⑴。 Dodson等~发现每3X 1〇⁶个骨髄单核细胞中，55天龄 SD大鼠MSCs数里为3.6 ±2.3523个，而18-22月龄大 鼠仅0.45±0.6863个。MSCs数缳的下降也和MSCs本 身的寿命减短有关，Stendeoip¹³¹发现虽然短期内老年 MSCs增飱能力的下降并不明显，但长期体外培养时，老 年人MSCs仅能成倍扩增24±11代，而宵年人MSCs能 够扩增41±丨0代。MSCs数世的减少直接导致成骨细胞 的减少，是老年性骨形成功能减退的直接原因之一。

雌激素主要与雌瀲家受体（EK-a和ER-p)相互作 用以发挥效应，现在认为，雌激索不仅能够抑制破骨细胞 活性、促进破骨细胞调亡、延长成骨细胞寿命，而且作用 于受体后可以促进MSCs增殖，在转录水平提高 MSCs成骨细胞特征性蛋白如骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2，BMP2 )、械性磷酸解（Alkaline phosphatase，ALP)、I 5?胶原（Collagen I >、转化生 K 因 子 pi (Transforming growth factorpi，TGFpi)等的表达，而 这些蛋白是诱导MSCs向成骨细胞分化的主要因子。此 外，雌激索可以拮抗MSC向脂肪细胞分化。因此，绝经 后骨质疏松病人骨髄中脂肪成分增加，骨小梁体积减少 等都与雌激素水平的降低直接相关

24月龄

蛋白（IGFBP)-3,4,5的mRNA水平及其蛋白产贵也都 随增龄而下降。

本文作者所在的实验室比较了 4周龄、9月龄、24月 龄大鼠#髄MSCs的数最和股骨皮质中BMP2的含贵， 结果表明MSCs的数M和皮质骨中BMP2的含M均随增 龄而减少（图20-2)。

付髄间充质干细胞及生长因子含M的下降不单与骨 质疏松症的发病密切相关，还进一步影响到骨质疏松性 骨折的愈合过程。Ralph等^:9]发现6周龄大鼠股骨中段 钟折6周时基本愈合，而12月龄大鼠没有愈合倾向。我 们也发现.卵巢摘除大鼠股骨中段骨折后，愈合过程中软 骨内成骨阶段明显延缓^:KMn。

除雌激素外，与成骨细胞分化增殖密切相关的生长 因子含里也随年龄的增长而下降。存在于骨组织中的生 长因子可能来自血循环或由针组织中多种细胞所合成。 随年龄的增长，针组织中成骨刺激因子，如BMPs、 TGF P、膀岛素样生长因子 I (insulin - like growth fac­tor, IGF - I)、成纤维细胞生长因子（ fibroblast growth factor, FGF)及血小板源性生长因子(pledet _ derived growth factor,PDGF)等都减少了。Icolas 等检测表明， 60岁老年人骨的TGF p含里比20岁靑年人净减少了 60%,IGF- I 减少了 25%。Kveiborg 等⑷用 RT-PCR 技术检测发现，老年人IGF- I的mRNA的水平进行性 下降，是音年人的49.9 ±4.9%,胰岛素样生长因子结合

雲

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9月龄  24月龄

阁20-2 4周龄、9月龄、24月龄组的CFU-F个数有显著性差异（丨^>均<0.05)。4周龄组股骨皮质 中BMF2含撤显著商于其他两组（P<0.05),9月龄组与24月龄组间差异不显著（P>0.05)

二、骨质疏松症的细胞和基因治疗（Cell and gene therapy for osteoporosis)

1.  骨质疏松症的细胞治疗（Cell therapy for osteoporo­sis〉 既然骨质疏松的骨童 减少与成骨祖细胞数 》的减 少密切相关，那么将MSCs经体外培养扩增后再回输到 已有骨质减少的病人体内，是否可以补充体内的干细胞 库，增加体内的干细胞数S,以达到防止骨质疏松的目的 呢？ Gasser等^:12]将1 X 1〇⁷个MSCs通过尾静脉注人去 卵巢骨质疏松大鼠体内，注射后4小时及24小时检测发 现，这些细胞并没冇像想像的那样主要聚集于骨组织，而 是主要聚集在肺、十二指肠、脾脏、胸腺，其中肺组织最 多，胫骨中只发现了 800— 1900个细胞。注人体内的 MSC约在7天内被巨噬细胞淸除。组织学及pQCT检 测M示这种方法没有在任何程度上阻止或改莕去卵巢骨 质疏松大鼠的骨丢失现象。他们同时也发现，局部注射 的方法，即在胫骨干骺端局部直接注人MSCs，也不能阻止 骨质疏松大鼠的骨丢失。这说明，在雌激素缺乏的情况下， 以分解代谢活跃为特征的《部环境不能提供MSCi向成骨 细胞分化的必要刺激所以认为，只有将MSCi结合在有骨 诱导活性的載体材料上,或通过基因治疗使细胞能够表达成 骨诱导因子如BMP或TGF-p,通过自分泌方式诱导MSCs 分化为成骨细胞，才可能达到M著的骨再生效果。

此外，许多研究证明MSCs对Dex和BMP2的反应 活性也不受供体年龄因素影响，hBMP2同样可以在老年 体内有效诱导成骨。Turgeman等应用一个骨质疏松病人的hMSCs,经hBMP2基因修饰后成功地修复了 4〜8 周龄大鼠桡骨骨缺损，这对骨质疏松的基因治疗是一个 很好的提示。

2•骨质疏松淀的基因治疗（Gene therapy for osteopo­rosis) 基因治疗的早期槪念是向粑细胞引人外源性基因， 以纠正或补偿其基因缺陷，在基因水平上对遗传缺陷进 行纠正。但随着基因治疗技术的发展，基因治疗已经不 再局限于治疗遗传性基因缺陷性疾病，而是成为一种新 的给药手段，即将外源基因导入目的细胞并在体内有效 表达，从而达到治疗目的。美国FDA在1993年给人类 基因治疗下的定义为：“基于对活细胞遗传物质的改变而 进行的医学治疗，这种改变可在活体外进行，然后应用于 人体，或者直接在人体内迸行”。从该定义可知，基因治 疗有两条技术路线，即育抟体内法（in vivo)和间接体内 法（ex vivo)。前者指将具有治疗作用的基因直接转人病 人的某一特定组织细胞（靶器官）并使其表达目的蛋白, 方法简便易行，但存在转染效率太低的问题。目前研究 最多的是间接体内法，指将试验对象的细胞（靶细胞）取 出，体外培养后导人外源基因，而后将这些经遗传修饰后 的细胞東新输回试验个体体内，使携有外源基因的栽体 细胞在体内表达目的蛋白以达到治疗目的（图20-3)。

将基因导人目的细胞需要合适的载体。目前可供选 择的基因转移载体主要包括病毒载体，如逆转录病毒载 体（VR)、腺病毒载体（Ad)、腺相关病毒软体(AAV)、单纯 疱疹病毒载体（HSV)等，和非病毒载体（脂质体和分子偶 联载体等）两大类。在大多数情况下，病毒栽体的基因转成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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