成都华西华科研究所分析骨髓基质干细胞培养与QCT骨密度软件体模检测

骨髓基质干细胞的培养 (Culture of bone marrow stromal stem cells,BMSSCs)

一、骨髓基质干细胞的分离、纯化（Isolation and purification of BMSSCs)

(一）  骨髓标本的准备

在知情同意和伦理许可的情况下，从志愿者供体的 髂后上嵴或胸骨穿剌吸取适M的#觭（1〜2mL),收集在 含有肝索抗凝（200IU/mL)的50mL聚丙烯管中，混合均 匀。骨髄细胞用含有5%胎牛血淸Q’etal calf serum, FCS)的Hanks缓冲盐溶液（HBSS)或磷酸盐缓冲液 (PBS,pH7.35)以1:1比例稀释，备用。

(二）  骨髓基质干细胞的分离、纯化方法

J.细胞貼壁分离法 Fricdenstdn等^[11敁初采用貼 檗分离法，从出生后动物的骨髄基质中分离出BMSSCs。 在轺料培养皿中放置全骨髄标本，约4h后倒掉未貼壁细 胞，弃去大部分造血干细胞（haematopoietic stem cells, HSCs)及其子代细胞，少数贴壁细胞呈异质性，大部分紧 密貼壁细胞呈针形，并形成2〜4个细胞的聚集体，聚集 体细胞经4天的休眠期，开始迅速增殖，形成克隆。 体外培养传代数次后，貼壁细胞成为一致性的针形细胞。

2.密度梯度离心法使用密度梯度离心法可分离 骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells, BMMNCs)〇 Haynesworth ²¹ ^ Bruder^JiJ ^ Jaiswal ⁴¹ » Pit- tengei•等⁵¹等使用密度梯度离心法结合贴壁分离法有效 分离了骨髄基质干细胞，并进行了生长动力学及多分化 潜能的体外研究。通常使用的密度梯度分离液存多种， 包括 Lymphoprep'Ficoll 和 Perco丨1 等。如使用 Lym- phoprep(丨.OWmg/mL)分离液，以1:2比例先后放罝分离 液和等倍稀释的骨儲标本，避免二者混合；在800g下离 心20〜30min,用移液管转移中间浅黄色层（Buffy coat), 即为HMMNC层。然后，在含有15%FCS的培养介质中 250g离心丨Omin.弃上淸液，收获细胞，计数，接种。细胞 贴壙生长后，呈成纤维细胞样形态，原代培养5〜7d生成 肉眼可见的匀称克隆。

3•荧光活化细胞分类^[61可使用单标记法分离 BMMNC中STRO-1阳性细胞。用密度梯度离心法分 离人BMMNCs,将BMMNCs审悬于阻滞缓冲液中（HBSS+ 10mM Hepes,5% FCS, 1% 正常人 AB 型血淸和 1% BSA),置于冰上孵育30min以阻滞与Fc受体的非特异 性结合。离心获得含有大约1 x 1〇⁷细胞的细胞团，并重 悬于含有200_ML未稀释的小鼠抗人STRO~ 1单克降抗 体上淸的离心宵中，置于冰上孵育lh,间或混匀；取2 x 10⁵细胞同样处理，用流式细胞仪技术进行表型鉴定。在 另一离心管中，2xi〇⁵〜5X丨〇⁵细胞在相同条件下以小 鼠单克降同型IgM阴性对照抗体处理。以HBSS+596 FCS漂洗细胞，然后加人100_ML第二抗体_M链特异性山 羊抗小鼠丨fjM-FITC(l:30稀释），冰上孵育45min，HB- SS+5% FCS中漂洗两次。荧光强度高于同型匹配对照 抗体反应99%的细胞被认为STRO-1阳性。上述用于 表型鉴定的细胞東悬于50(VL FACS固定液（含1 %福尔 马林的PBS + 0.02g/mL葡萄糖+ 0.01%叠款钠）中， 备用，并可于4^：下贮存数周。

1.  磁性活化细胞分类^[6、⁷¹ Gronthos和Simmons最 先使用该方法从BMMNCs中大里分离STRO- 1阳性骨 髄基质前体细胞。在离心管中将大约1 x l〇⁸BMry!NCs 重悬于lmL含有STRO-1抗体的上淸液中，于冰上对 Slh，其•间偁尔混匀，使之处于单细胞悬液状态。然后， 在含有〗％BSA的HBSS中漂洗两次。将细胞重悬于 lmL含有生物索标记的第二抗体_M链特异性山羊抗小鼠 l_gM(l:50稀释〉的缓冲液中，冰上放S45min。在MACS 缓冲液（无 Ca²⁺、Mg²⁺ 的 PBS + 1%BSA+ 5mM EDTA f 0.01%叠氮钠）中溧洗两次，在真空下驱除气泡以免 影响磁柱基质。离心后，束悬于9(MVL MACS缓冲液中， 再加人100pL链霉素卵白素微珠。冰上放置15min.直 接加人链霉索卵白索-FrrC连接（1:50稀释），继续孵 宵5min。再于MACS缓冲液中漂洗两次.取其中少虽细 胞悬液作流式细胞仪分析，其余细胞悬液®于微型 MACS磁柱中分离STRO - 1阳性细胞◊使用 50C^LMACS缓冲液淸洗磁化的柱子，去除磁柱基成保护 层。将lmL细胞老:液加人柱中，并以0.3mL/mi_n流率通 过。收获流经磁柱的STRO-1阴性细胞，放置冰上。加 lmL MACS缓冲液淸洗磁柱，然后将磁柱从磁装M中取 出，用2mL MACS缓冲液冲洗磁柱，收获STRO- 1阳性 细胞，最后，使用流式细胞仪分析所收获STRO-1阴性 和阳性细胞的纯度。取STRO-1阳性细胞进行体外培 养和分析。

二、骨瓶基质干细胞的鉴定（Identification of

BMSSCs)

(一）骨髄基质干细胞的表型特征

除了具有克隆形成、自我更新和多分化潜能特性外，骨髄基质千细胞表达一系列一致的细胞表而分子，这些 细胞表沏的表达也足BMSSCs鉴定的重要依据。通过流 式细胞仪分析，证明分离培养的骨髄基质干细胞为含有 一致表型的细胞群体，在第1、2次传代时分别具有95%、 98%的同源性〇这些貼壁扩增的细胞M —致性的SH2、 SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106' CD120a、CD124 及许多艽他衣面蛋白的阳性表达。此外，几种用来识别 造血细胞的抗体也已常规用于阴鉴定扩增的#髄基质干 细胞，如脂多铕受体CD24、CD34、白细胞共同抗原CD45 等在造血细胞皁阳性的标记，在基质千细胞则呈阴性^lsl。 Joyner等证明小鼠HOP - 26抗体可识别人骨髄基质成 纤维细胞克降形成单位（Colony forming unit ^_ Fibro­blasts, CFU-F〉¹⁸¹,但未能确定 CFU-F 究竞是所有骨 髄基呔系统的前体细胞，还是唯一的骨祖细胞前体细胞。 Simmons等研究表明，某些骨髄基质细胞亚群表达一种 可被STRO-1抗体识别的农面蛋d^t9]。这些细胞亚群 在适宜的体外培养条件下形成矿化基质，并表达诗特异 性蛋白钟钙素。但尚末证明这碑细胞亚群足唯-的骨祖 细胞来源。在此基础上，Encina，使用结合小鼠STRO -1抗体的磁珠识别骨髄基质细胞表而蛋白，特异性分 离出人骨m细胞^lw]。经长期培养，所有细胞分化为成骨 细胞谱系，表现成骨细胞形态学特征、碱性磷酸酶活性增 强、表达骨特舁件蛋白骨钙素及矿化某质形成。由于抗 表曲抗原的吶克降抗体的产生，大具有高度调节作用 的BMSSCs表面分子得以鉴定。因此，要获得足够数贵 的BMSSCs,可利用BMSSCs体外培养过程中貼壁生长的 特性及一系列细胞表曲标记蛋白，对其进行分离、纯化和 扩增。

(二）克隆形成效率分析

CFU-F分析是确定#髄基质十细胞数m或克隆形 成效率的体外分析方法。通常将克隆形成效率定义为每 1XH)⁵骨髓有核细胞中CFU-F的数墩。正常骨髓中 的BMSSCs数蜻很少，且随增龄或疾病而减少。如 正常新牛儿骨髄中的BMSSCs占全部有核骨制细胞的 1/10 000,10 岁以上占 1/100 000,50 岁以上占 1/400 000, 80岁以后则占1/1 000 000〜2 000 000("】。Egrisc等研究 表明，21月龄大鼠股骨千骨髄屮的BMSSCs数较4月 龄者明显减少，经体外培养，形成的成纤维细胞克降形成 申位数饋及具有成骨细胞样表®特征的贴壁细胞也明显 减少^[|21。

三、骨髄基质干细胞的诱导分化（Induced differentiation of BMSSCs)

体外培养扩增的骨髓基瘐干细胞，在特定诱导因+ 作用下，具有多分化潜能特性，移植于体内不同环境或部 位，也呈现适应该特异环境或部位的表型衣达，如可分化 为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，而且己经建立了较 为稳定的体外诱导培养条件。

(一）向成骨细胞的分化

1.向成骨细胞分化的培养条件使用基础培养介

质(Alpha - Minimal essential medium，ct MEM 中含有 15% FCS, 2mM L -谷胺酸盐，lOOIU/mL 靑霉索， lOOmg/ml.链宵索），在37t：、5% COj、饱和湿度下培养全 骨髄细胞、BMMNCs、或STRO- 1阳性的BMMNCs,7d 后苜次换液，改用成骨性培养介质（基础培养介质中加 10 ⁸M地塞米松，10mM p-甘油磷酸钠，50pg/mL维生 索C)继续培养，每周换液两次，培养至4〜6w时检测成 背细胞表翌表达。此外，尚有类似的成骨性培养介质 (Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM 中含有 10% FCS，2mM L -谷胺酸盐，lOOlU/mL 靑葙家，lOOmg/mL 链霉索，10 ⁷M地塞米松，〗0mM p- ti■油磷酸钠，50_MM 抗坏血酸盐-2-磷酸盐）~。其中，维生素C是胶原中 赖氨酸和羟脯钗酸羟基化的辅助因子，也是胶原正常合 成与分泌的必须成分，并可增强的胶原mRNA的转录和 稳定性。P-甘油磷酸钠则是细胞外基质（Extracellular matrix, ECM)矿化过程中磷酸根离子的原料来源。生理 浓度的地塞米松可促进骨髄基质干细胞的增殖和/或存 活，促进骨生成细胞讲系己分化表型的表达，维生素C类 似物和甘油磷酸钠则能够进一步支持其表型的表 达^[13]。成骨性分化的特征性表型包括碱性磷酸酶活性J 型胶原和骨钙素表达，以及细胞外基质矿化形成骨结节。 在透射光显谗镜下，光线难以透过钙化基质。使用趋骨 性四环索活体标记后，在荧光显微镜下M现金黄色荧光。 使用茜素红或Von Kossa染色，则呈现阳性钙质反应。 阿利新蓝和Sirius红染色后，新生骨结节或结构中的胶 原和酸件粘多铕成分得以M示出来。

2.   趋骨性荧光素（四环素）标记于长有圆形 或薄片样钙化结节的培养瓶中加人四环素溶液，得终浓 度为50_Mg/mL培养介质.将培养瓶架于转鼓中继续旋转 培养30min,转速lOr/min。然后，弃去含有四环索的培养 介质，加人新鲜培养介质继续孵拜30min。HBSS液漂洗 后，95%乙酵闶定20min,于荧光显微镜下观察，阳性结 节呈现金黄色荧光。

3.  茜索红S染色^1M.⑴BMSSCs在成骨性培养介质 下,3〜6w时，出现不透光钙化结节，经95%乙醉固定 20min,PBS冲洗5min2次，于0.1 %茜索红S溶于pH8.3 的Tris-HCI缓冲液中孵育30min,使钙质染色，光学显 微镜下观察，阳性钙质染色呈红色。

4.  Von Kossa染色》 不透光钙化结节出现后，将标 本在〖0%中性缓冲福尔马林溶液中固定lh,去离子水冲 洗5min2次；加人2%硝酸银（w/v)溶液，在黑暗中孵育 lOmin;然后在紫外光或H光下照射15min,弃去硝酸银 溶液，去离子充分冲洗；在5%亚硫酸钠溶液中漂洗 5_min,不必复染，光学显微镜下观察，阳性钙质染色呈黑 褐色。

5.   阿利新蓝-Sirius红染色^h5钙质染色观察 后，将标本在1%阿利新蓝溶于3%醋酸溶液中染色 30min;然后，再于0.2% Sirius红溶于3%饱和苦味酸溶 液中染色30min。这样，钙质和茜素红染料被醋酸和苦 味酸溶解，酸性粘多糖和胶顷便SJ淸晰地显示出来，酸性粘多糖呈蓝色、胶原呈棕色。

6.  碱性磷酸酶染色和酶活性测定通常使用碱性 磷酸酶染色试剂盒和碱性磷酸酶活性测定试剂盒（Sigma 公司）进行检测，遵照相应说明进行操作。

7.  成骨细胞表型表达的鉴定成骨细胞表达一系 列特征性表绡，包括表达I型胶厣、骨钙素、骨桥蛋白、# 涎蛋白、骨连接蛋白，以及特异性转录因子CbfahOsterix 等。这些因子的表达可通过免疫细胞化学、逆转录-聚 合解链反应（RT- PCR)或蛋白质印迹（Western blot)等 方法来检测。

(二）   向软骨细胞的分化

1.  向软骨细胞分化的培养条件通常使用的软骨 生成性培养介质为无血淸DMEM,其中含有ITS/Premix (6.25 mg/mL 膜岛素，6.25 mg/mL 转铁蛋白，6. 25 mg/ mL亚油酸，5.35 mg/mL亚晒酸，1.25 mg/mL牛血清白 蛋白），丙酮酸盐（1 mM)和抗坏血酸盐-2 -磷酸盐 (37•5nlg/mL)，以及TGF-pl(0•5~10ng/mL),存或 无1(T⁷M地寒米松^:|7"⁸¹。另外，亦有使用含有TGF-聆 的无血淸条件介质W。在这些条件下可进行BMSSCs单 层细胞或细胞团的诱导培养。如离心获得的人胥髄基质 干细胞团，在含有上述无血淸条件介质中培养，形成多层 状结构，使用单克降C4F6检测到作为软骨典型特征的II 沏胶原，组织切片中坷见软骨细胞样陷窝形成、广泛的细 胞外基质离含aggrecan和丨丨型胶原^[51。

2.   细胞团的悬浮培养用0.25%胰蛋白酶/ED- TA消化液消化貼壁生长的BMSSCs,计数，将2X丨〇⁵细 胞東悬于0.5mL介质中，在15mL聚丙烯离心管中以 500g离心，获得细胞团，在上述软骨生成性培养介质中 诱导培养。通常在24h内，细胞团脱离管壁。每2〜3d 换液一次，持续培养21d,进行诱导性软骨生成的检测。

3.  阿利新蓝染色BMSSCs在软骨生成性培养介质 中培养2〜3w,细胞体积增大，结节形成。将诱导分化的 细胞在95%乙醉中固定20min,蒸馏水漂洗5min2次，在 1%阿利新蓝溶于0.1N盐酸（HCI)溶液（pH 1)中染色 30min，蒸馏水充分漂洗，空气中干燥，封片，光镜下观察。 蛋白多糖呈蓝色。

4.  软骨细胞表型表达的鉴定诱导分化的软骨细 胞表达的特征性表铟包括D铟胶厣、X塑胶原、蛋白多糖 成分如aggrecan、decorin、biglycan,以及糖胺多糖和硫酸 软骨素的合成等，其mRNA和蛋白的表达可通过相成的 分子生物学或生物化学技术来鉴定，不冉赘述。

(三）   向脂肪细胞的分化

1.向脂肪细胞分化的培养条件传代培养的 BMSSCs接近铺满时，改用脂肪生成性培养介质（DMEM 中含有10% FCS,0.5_mM地塞米松,0.5mMl-甲基- 异丁基黄嗓呤，50pM Indomethacin,100 IU/mL 青霉 素，100mg/mL链霉家）培养，每2〜3d换液，3w时，呈现 脂肪细胞性分化^[|9]。细胞内聚集丰甯的脂肪小泡，并随 时间不断扩大、融合，最终充满整个细胞。

[16]    油红O染色将诱导分化的脂肪细胞在丨〇%中 性缓冲福尔马林溶液中固定lh,蒸馏水漂洗5min2次； 人新鲜配制的油红〇溶液内（O.lg油红〇溶于98%异 丙醇100mL,用时取6mL加蒸馏水4mL,静置lOmin,过 滤使用UOmin,蒸馏水漂洗2min2次；苏木素染核，流水 冲洗lOmin,甘油封固，光镜下观察。脂滴呈红色，胞核 蓝色。

[17]    苏丹IV染色将诱导分化的脂肪细胞在10%中 性缓冲福尔马林溶液中固定20MIN,蒸馏水中漂洗1次， 70%乙醇溶液中快速溧洗2次；然后置于苏丹W溶液（将 苏丹IV以0.1g/mL w/v溶于1:1/丙酮：无水乙醉中配制 而成）中孵育5〜lOmin;弃去苏丹IV溶液，在75%乙醉溶 液中分化2 — 5s,用蒸馏水彻底冲洗，空气中干燥，封片， 光镜下观察。脂滴呈鲜红色。

[18]    脂肪细胞表型表达的鉴定脂肪细胞表达的特 征性表甩，包括转录因子PPARr2、CEBP/a,以及早期或 晚期标记如脂蛋白脂鵾（LPL)和脂肪酸连接蛋白_ttF2等 的表达可通过免疫细胞化学、RT-PCR或蛋白质印迹等 方法来检测。

四、骨髓基质干细胞的冻存^[6] (Cryopreser- vation of BMSSCs)

将貼壁生长的骨《基质干细胞在含有0.25%胰蛋 白酶和2mM EDTA的消化液中，37t：条件下孵育 lOmin,获得单细胞恳液。加人等M的含5% FCS的HB- SS以终止消化，并稀释、清洗细胞。离心后，获得细胞团 块，重悬于冻存介质（丨0%DMSO + 9096FCS)中，细胞密 度为lxl〇⁷细胞/_mL冻存介质。将冻存管貲于冰上，分 装细胞悬液，lmL/管。然后，在冷冻器中冷冻细胞，降溢 速韦控制在-lt：/min。最后，将冻存管置于液氮中长期 保存。复苏细胞时，将冻存符置于37X：水浴中快速解 冻，重悬于含5% FCS的HBSS中，计数后接种培养。经 过上述冻存后，细胞复苏率约为60%〜70%。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
网址:http:// www.qctqct.cn  
手机 : 13072875151传真 :028-65830598
市场部电话 :028-65830598 028-67708638  83190122
在线 QQ:110480527 联系人 : 王先生
邮箱:samwangcn@126.com
地址 : 成都市静康路536号