成都华西华科研究所分析2型糖尿病相关基因检测方法研究进展与糖尿病早期无创检测诊断方法 

【摘要】2型糖尿病是一种多基因遗传病，具有较强的遗传倾向，受遗传和环境等多因素相互影响。随着人类基因 组计划的完成，揭开了人类遗传信息的秘密。人类已了解自己基因组的全部核苷酸序列，在全面寻找功能基因的同 时，“人类基因组计划”的另一个重要目标是阐明在特定基因组区域内的序列差异。同时，基因检测的方法也在不断 改进，本文就2型糖尿病相关基因的检测方法综述如下。

1 2型糖尿病的SNP(单核苷酸多态性}检测方法基因结构的异常可引起多种疾病的发生,它包括 点突变、缺失、插人、易位、重排、基因扩增、基因结构 多态性异常等形式。许多人类遗传性疾病源于基因的 突变，基因突变分析是指对单个或低拷贝基因序列 等位基因改变的鉴别，对诊断和理解遗传病有非常重 要的价值^[11。单核苷酸多态性是指基因组水平上由 单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，在群 体中的发生频率不小于1%。SNP因为具有密度高、富 有代表性、遗传稳定性高、易于实现分析的自动化等 特点而作为遗传标记得以广泛应用^[2]。随着人类基 因组计划的完成和单核苷酸多态性(SNP)筛查技术 的发展，已有多种SNP分析应用于人类疾病的分子生 物学研究。常用于2型糖尿病相关SNP的检测方法，文 献报道较多的有AS-PCR(等位基因特异PCR)，RFLP (限制性片段长度多态性）。

1.1 AS-PCR(等位基因特异PCR)

AS-PCR是根据SNP位点设计特异引物，其中特 异链的3'末端与SNP位点碱基互补或相同，普通链 按常规的方法进行设计，因此,AS-PCR是一种基于 SNP的PCR标记。由于特异引物在一种基因型中没有 扩增产物，在另一种基因型中有扩增产物，因此用凝 胶电泳就能分辨出扩增产物的有无，从而确定基因 型的SNPP1。李晓晶等，运用等位基因特异性聚合 酶链式反应（AS-PCR),研究内蒙古地区汉族人群CD KALI 基因 rs4712523 和 SLC30A8 基因 rsl3266634单核 苷酸多态性(SNP)的等位基因和基因型频率分布与2 型糖尿病(T2DM)的相关性。结果证实了以上2种基 因可能是内蒙古地区汉族人T2DM的易感基因。为了 实验的准确性，研究者将每种基因型的产物通过切 胶回收连接T载体，进行测序。并且抽取10%的样本重 复进行基因分型，其一致率为100%。胡春萍曰等，针对

作者简介：董志明（1986-),男，内蒙古包头市人，住院医师，在读硕 士研究生,从事内分泌系统疾病的诊疗工作。

脂联素基因的5个SNP位点设计野生型和突变型特 异性引物，建立了等位基因特异性PCR检测脂联素 基因与2型糖尿病相关的SNP位点。最后用DNA测序 证实等位基因特异性PCR的检测结果。结果表明该检 测方法对研究样本均有扩增，且每个SNP位点均检出 相应的基因型个体。测序结果与等位基因特异性PCR 检测结果吻合。上述实验中所应用到的直接测序是最 精确的SNP检测方法。它通过对不同个体同一基因或 基因片段进行测序和序列比较，以确定所研究的碱基 是否变异，其检出率可达100%。通过直接测序可以 得到SNP的类型及其准确位置等SNP分型所需要的 重要参数。虽然特异基因序列区段的直接测序是基 因突变分析最可信和最精确的手段，但该方法存在 繁琐、耗时、费力等不足之处。故直接测序只能应用 于AS-PCR的样本检测。

1.2 RFLP(限制性片段长度多态性）

由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的 切点出现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时， DNA片段长度出现差异,这种因内切酶切点变化所导 致的DNA片段长度的差异，称限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymporphism,RFLP)。 RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性 变异，它按照孟德尔方式遗传。其原理为两种或两种 以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，利用限 制性内切酶的酶切位点的特异性，若存在SNP位点， 酶切片断的数量和长度就会出现差异,根据电泳结果 判断是否SNP位点。应用该技术的前提条件为SNP的 位点必须含该限制内切酶的识别位点，它是筛査SNP 最经典的方法之一。经典的RFLP技术虽成本较低， 但步骤多、速度慢，难以实现高通量的基因型SNP检 测^[7]。PCR(聚合酶链反应)是一种高灵敏性和高特异 的基因分析手段，PCR操作简便，可在数小时内使DNA 段的拷贝数扩增百万倍，使对微量DNA的鉴定分析成 为可能，此应用提供了一系列比直接测序更方便、快 捷的方法。PCR在此领域也引起了巨大的革新^[8]。

包头医学2014年第38卷第1期

PCR-RFLP(限制性片段长度多态性）是利用PCR扩 增目的DNA，扩增后的产物再用特异性内切酶消化切 割成不同大小的片段，由于不同等位基因的限制性酶 切位点分布的不同，所以产生的DNA片段条带的长度 也不同，最后可以直接在凝胶电泳上分辨。此项技术 提高了目的DNA的含量和相对特异性，方法简便，分 型时间短。这种方法与RFLP相比，不同的是以扩增 代替了酶切,避免了 RFLP繁琐的DNA酶切、转移、杂 交等步骤^[9]。杨慧英^[1〇!等，运用PCR-RFLP检测脂联素 SNP+45 (T/G)的多态性。得出的结论为：昆明汉族人 群脂联素SNP+45(T/G)多态性的分布与国内的其他 地区类似，但是与德国的人群有显著差别。2型糖尿 病患者GG基因型的频率明显增高,GG型HOMA-IR 明显增高、HDL-C明显降低。从而证明昆明汉族人 群脂联素SNP+45 (T/G)多态性与2型糖尿病相关， GG型基因可能是中国昆明汉族人群2型糖尿病的遗 传危险因素。

1.3基因芯片技术

生物芯片借用了计算机芯片的集成化特点，把 生物活性大分子（主要是蛋白质和核酸）或细胞等， 密集排列后固定于固相载体上，形成微型的检测器 件，固相载体通常是玻片、硅片、尼龙膜或聚丙烯等， 故狭义上的生物芯片也称微阵列芯片，主要包括cD- NA、寡核苷酸、蛋白质、细胞和组织微阵列。其特点 为在面积不大的基片上有序地点阵排列了一系列固 定于一定位置、可寻址和识别的生物分子微电子学 的并行处理和高密度集成的特点，可对生物分子进 行快速并行处理高通量，高信息量、快速、自动化。基 因芯片是生物芯片的代表。它是将多个特定的SNPs 或基因片段按特定的规律排列固定于支持物上，然 后通过类似于Southern, Northern的方法与待测标记 样品按碱基配对原则杂交，再通过检测系统进行扫 描，用相应软件对信号进行检测，得到所需信息，进 行基因的高通量、平行化、大规模、集约化的功能研 究和信息处理^M。朱沂〃²¹等，运用基因芯片技术筛查 了 2型糖尿病患者早期大血管病变的易感基因和 SNP位点。共筛选出在病例组和对照组之间有显著 差异的SNP位点452个，其中处于T2DM大血管病变 主要代谢通路相关基因内或者附近的SNP位点37 个，通过这些SNP位点锁定T2DM患者大血管病变易 感基因30个。进而证明T2DM大血管病变受遗传多态 性影响，可能与多个基因以及位点相关。

2 2型糖尿病基因差异表达的检测

在真核生物中，从个体的生长发育、衰老死亡， 到组织的分化、调亡及细胞对各种生物因子、理化因 子的应答,其本质都涉及到了基因选择性表达。高等 生物中约有3万个不同的基因，但是在生物体内的任

意细胞中只有百分之十的基因可以表达，这些基因的 表达按照定某种特定的时间和空间顺序进行着，这 种表达方式称为基因差异表达。生物体表现出的各 种特性，主要是由于基因的差异表达引起的^[13]。随着 人类基因组测序的完成,以基因组功能研究为主要目 的的后基因时代的来临,功能信息的获取将成为基因 研究的重点。基因差异表达分析是获取基因信息的 重要方法。最近研究认为,2型糖尿病不仅与DNA水 平上某些位点的结构异常有关,也可能与基因的表达 水平有关，因此有必要从基因表达水平进一步研究 其发病机制^[14]。郑骄阳^[15]等，应用基因芯片技术，对 大网膜组织胰岛素抵抗相关基因进行了研究，研究发 现胰岛素抵抗组和对照组之间共筛选出82条差异表 达基因。其中信号转导相关差异表达基因19条，表达 增加的基因12条，表达降低的基因7条，然后再经RT- PCR验证，胰岛素抵抗组MKP24表达明显升高。从而 证明了胰岛素抵抗和信号转导之间有密切关系。赵晓 龙^[161等，用基因芯片技术对糖尿病患者与正常对照 组的肝脏组织基因表达谱进行分析,总共有492条基 因表达上调，820条基因表达下调；其中差异表达明 显的基因的代谢通路涉及到胰岛素信号通路、脂代 谢、糖代谢等。从而证明，糖尿病肝脏与正常肝脏组 织基因表达谱的变化主要表现为在糖、脂代谢和胰 岛素信号通路等的改变，肝脏在糖尿病发病机制中的 作用可能与其参与糖、脂代谢和胰岛素的作用异常有 关。无论是大网膜组织，还是肝脏组织，对人体都为 有创检查，受到了取材的限制，血液是最方便、最常 用的检测样品，应用基因芯片检测糖尿病外周血相关 基因差异的表达将为糖尿病的基因诊断提供广阔的 前景。

3展望

无论在单核苷酸多态性的检测中，还是在基因 差异表达研究中，基因芯片技术以其高通量、大规模、 平行化、集约化等特点，在2型糖尿病基因检测中占 有重要地位。其未来的研究发展方向为:进一步提高 探针阵列的集成度;提高检测的灵敏度和特异性；高 自动化、方法趋于标准化、简单化，成本降低;高稳定 性；研制新的应用芯片、芯片新检测系统和分析软 件，以充分利用生物信息;基因芯片技术同其它技术 联合使用，比如基因芯片PCR、纳米芯片等；不同生 物芯片间的综合应用，如基因芯片与蛋白质芯片之间 的相互作用，可用于了解蛋白质与基因间相互作用的 关系^[17]。

 成都华西华科研究所研发生产多种糖尿病及并发症早期无创检测诊断系统

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