成都华西华科研究所分析PTH测定方法及其演变与QCT骨密度软件体模检测

PTH测定方法及其演变和进展（Progress and advances in immunoassay for parathyroid hormone)

(一）放射免疫法（Radioimmunoassay, RIA)

20世纪60年代初，Berson和Yalow用甲状旁腺提取 物为抗原制出抗体，建立了 PTH的R丨A(放射免疫测定） 方法^lM1。尽管其后发展了大S的取代型（或竞争型）的 PTH R1A方法，但都缺乏足够灵敏度，甚至不能检测正 常生理水平的激索；特异性也不足以专一地检出活性的 完整PTH^fm〜。特别是在早期，用牛甲状旁腺提取物 作抗原来制备抗体，又是用牛¹²⁵丨-bPTH作为标记配体 (因牛PTH含酪氨酸能被碘标记），所测人血样结果，无 论用牛或人的PTH作标准物，都没有剂里-反应曲线的 平行性或健全性（validity)#³。是故早期锌经用合并的 甲旁亢血淸混合物作标准物，以血样中PTH相当多少混 合血淸的微升数作为衡簠单位以克服不平行性。这 种单位实际是任定（arbitrary)的，例如相当于多少自制标 准血淸的微升当1数（H-Eq)或纳克当童数（ng - Eq)。 佴正常值需先确定好，并要求制标准血淸必须同世界 U生组织提供的免疫测定人PTH的闻际研究标准 (International Research Standard)进行校正

后来，有了 PTH纯品，特别是人工合成了 PTH的不 同肽段：除叮巧^外，更有15 - 21,28 - 48,44 - 68和 53-84等不同片段的化学品问市，PTH的放免法大大改 观◊现在可供应用的有三种区域特异性R丨A:C-端、中 区和N-端特异性RIA。

1.  C-端特异性R1A原先文献中所谓C-端特异 性，后来发现亊实上是中区特异的。故现将C-端特 异性界定为识别PTH的69-84区域者，以前PTH测试 药盒大多是这一类，现C-端特异的测试药盒仍有市筲。 所测PTH应包括所有具有C-末端者，即除PTH(1 - 84)和少最PTH(7〜84)外，大部分是C-片段，判定数据 临床意义时应注意。

2•中区特异性RIA用中区肽段，如44-68肽段为

抗原制备抗体，可以识别44-53区和53-68区；灵敏度 较高，可鉴别不同程度的甲旁低疝由于上述C-端 和中区特异性用词较不严格，于是有的将能识别44-84 区的方法称为“中分子-羧端”测定法。实际中区特异测 定的内容应涵盖血中的至少3个重要分子形式，即：完整 PTH、C-端片段以及去头PTH。同样，其中C-片段占 大多数。

1.  N-端特异的测定法也已有方法建立^[2“^22:。但 因灵敏度太低，不足以检测正常水平，甚至在原发性甲旁 亢的诊断上都无甚用途^h71。Peninsula Lab(美国，加州， Behnom城）供应一种特异地专一地只能测人 kit(Cat.No. R丨K-6101)。其抗体对人 PTHU-84)的 交叉反应仅为1 %,不能用于测定含N-端的完整PTH (1-84)。而人体内又无PTH(1-34)存在，故无临床用 途。实际上厂方也特别声明，只供研究用，不能用于临床 诊断（见该公司目录和该产品说明书）。

(二）免疫放射測定法（Immunoradiometric assay, IRMA)

方法学上的重要发展是检测完整PTH的双位免疫 放射测定法的建立¹²³³。面市药盒以Nichols Institute的

但足，由于N -端截短的PTH，即去头PTH7 - 84的 发现和存在，原先的双位IRMA不能辨别去头的和不去 头的PTH而在某些疾病条件下常出现假高值，新的方法

又应运而生。

(三）新一代的PTH测定法（Novel - generation immunometric PTH assays)

由于去头PTH或称非（1 -84)PTH(很可能是或主 要是PTH7-84)的发现，暴露出上述夹心法测定完整 PTH的缺陷。例如名牌测定试剂盒Nichols、lncstar和 Diagnostic System Laboratories kits 等都受非（1 - 84)PTH 的千扰而给出过高的ImactPTH假值^[26]。不但在肾袞 病人^(27],显示“完整” PTH过高的假象，而且在其它甲状 旁腺功能的病人，非（1-84〉PTH也有变化，因之也干扰 这些患者血中全长PTHU-84)的测定。例如在I型假 性甲旁低的病人，PTH(1 -84)和PTH(7-84)样的片段 均较正常人高，分别是26.8 vs 2.37和16.2 vs 0.82 pmol/L。注意后者，PTH(7-84)样片段在正常人才不到 1 pmd/L,而病人升高近20倍^:281。再如.合并继发性甲 旁亢的透析病人，为避免造成髙钙，而给予只抑制PTH分 泌而不引起高钙的羟化VitD骨化三醉(calcitriol)的衍生物

Allegro I-PTH IRMA kit为代表〇这类测定，采用识别 完整PTH分子不同部位的两个抗体：其一为过请的并固 相化的C-端抗体，可结合PTH1-84的C-端，可将血 样中的完整PTH和可识别的含C-端的片段（例如 PTH37- 84)悉数提取和捕获；将识别1-84 PTH另一 端（N-端）的第二抗体适宜地标记，即可以用〃⁵丨标记 URMA),也可以用酶（IEMA)或化学发光物质 (ICMA)^U4i标记，作为检测探针（hotter probe),检出具有 双表位的PTH〗 -84;而其他片段，因不含N-端而不被 检出（图18-1)。而且两个抗体的协同作用可提髙测试

22 -氧杂-#化三醉（maxacalcitol)治疗时，用顷先的I- PTHU-84)药盒测试，仍然有产生对真正1 -84 PTH水 平佔谩过高（可商于真值21%)的错误的极大危险性^[~。 当然原发性甲旁亢者真正PTH(1 -84)和PTH(7-84)样 的片段都比正常者高^[M](分别是53.5 vs 24.1和15.2 vs 6.1);但是(7 -84)样片段上升倍数更高，而且HPLC分析 结果表明原发甲旁亢者PTH(7-84)样肽段所占百分率也 高，分别是29.9% vsl4.7%^l3n。人们期待发展新的测定 方法，不受7-84样片段干扰的方法，准确地测定PTH1 - 84的真值_c

系统的动力学亲合势（avidity)，较准确地检出欲测分子。 还由于抗体分子可标记许多放射性，故可以“放大"（酶标 或化学发光同样），使灵敏度大大提高。再有，免疫测里 的灵敏度是抗体亲和力的函数，使用含有两抗体的测试 体系，其热力学的表观亲和力（apparent affinity)会大大提 高，可能由于有协同作用的两个抗体，它们的亲和力显示

乘积性而不只是加合性；结果，远高于任一单独使用时的 亲和力，也是灵敏度多倍提商的机制^[25]。

18- 1 双位点PTH(丨-84)的丨RMA,丨EMA或ICMA 测定法图解

Ab,(第一抗体）:C-埔特异性抗体

Abz(笫二抗体）：N-端特异性抗体，右上角的为标记物

左：夹心反应示意图，右：典茔标准曲线

最近，特异地识別人PTH的1〜6袄基酸序列的抗 体^和特异识别PTH第一位氨苺酸的抗体^{:30 311}制备成 功，建立了专门只能检出PTH1-84而不与PTH7-84 交叉反应的免疫放射（丨KMA)测定法，使完整PTH数值 更接近真实，更能准确地判断甲状旁腺功能^[30~。

John^[3^和Gao^w等人所建立的新的丨RMA法，主要是制 备对PTH第一位氨基酸识別的特异抗体(这是与Allegro kit 不同之处)作为碘标记检测抗体,而用对38-84肽段识别的 抗体固相化后作为自血标中提取带C-端PTH多肽的捕捉 抗体。这样只能专一地测定完整全长PTH(丨-84),而与去 头的PTH(7-84)样片段不发生反应^[30川。由于只有全长 PTH<1 -84)才能激活环化酶而产生cAMP,故这种测试又称 激活环KSJ^PTH(CA-PTH)澜定法^:2]。而把原来Allegro imact PTH kit简称卜PTH测定药盒。用卜PTH和CA - FTH两种测试法比较测定慢性肾哀小儿血样的差别。结果 表明:虽然可以认为两法测试数据有平行关系，但肾小球滤 过率降低和透析病儿，則去头PTH大片段的水平升高。而 且肾衰小儿中保守治泞者和透析者两种测定数据之间的平 行曲线的斜率也不相间^[52]。

后来有的用总PTH减PTH1 - 84求得PTH7 - 84

值来作为肾性骨病无创性诊断^lM1,以及试图用PTH1 - 84/PTH7-84二者比值是否小于1作为长期血透病人的 預后分界（cutoff)值^[M]和骨转换率评价指标但也有 相反观点，认为，比值不如苹测值好

最近，专一测定全长PTH(丨-84)的Bi〇-PTH(l - 84)免疫化学发光测试法（Bio-PTH ICMA),即第二抗体 不用放射性标记而用吖啶酯类标记的方法也已问市，对 该法的表征（characterization)、方法学考核以及应用，也做 了系统的工作

Bio- FTH丨CMA法的最低可测限（灵敏度）为3. 9ng/L,批内和批间变异系数分别为<2.8%和3.5%。其 标准曲线（图18-2)直至高达1800 ng/L范围内仍为线 性图形。加人过最丨000倍的PTH(7_84),测定体系仍 不受干扰。正常人（72名志愿者）22.2±7.1 ng/L，相当 于用I - PTH测试法的数据36.丨±22.3的62% ,说明正 常人血中PTH(7-84)样片段占I-PTH测定值高达 38%;原发性甲旁亢者（18例）升高为丨21±85 ng/L;自发 性甲旁低者（Idiopathic hypoparathyroidism)(n = 4)降低， 是 5.5±2.8 ng/L;血透病人（n = 177)平均为 102 ng/L， 但不同人之间数值高低相差甚大（SD高达丨04 ng/L);而 Paget病和骨转移病人则在正常人的范围之内，分别为 34± 15(n = 9)和 24± 12(n = 4)ng/L。在本章之末将 Inab_a^:36)等人的数据列举如上，供读者研究和参考。希望 引起对新一代方法的关注和对进一步研究的单视。

Bio-PTH (1 -84) ( ng/L) ( 20~1800ng^L)

图18-2 Bio-PTH Ai»ay的标准曲线示意图 依据丨_nab«^t36]文中 所述联理绘出的测定曲线模式图成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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