成都华西华科研究所分析双騰酸盐类的作用机制（Mechanisms of action of bisphosphonates)

双腾酸盐类（Bisphosphonates，BPs〉具有抑制转化和 抑制骨吸收两个基本作用.》BP.s抑制钙化的作用机制是 物理化学作用，前面已有叙述。

BPs抑制骨吸收的作用机制，早期（1%9)认为是与 焦磷酸盐（pyrophosphate, PPi) —样，通过物理化学机制附 止轻辑灰石（hydroxyapatite HA)的溶解，但BPs抑制HA 溶解用激大，而抑制骨吸收用M小，以后开发有较强抑制 骨吸收作用的BPs用最史小，不可能达到抑制HA溶解 的作用。无论在实验室或活体均发现BPs抑制HA的溶

解和抑制骨吸收之间没有关系，因此抑制骨吸收不是物 理化学作用，而是通过骨细胞的生物学作用。

1.  双膦酸盐类在组织水平的作用机制骨重建 (Bone remodeling〉是骨舱在组织水平参与机体代谢，适应 力学功能的自我调节的过程。

骨的审建是以骨的吸收开始，以骨的形成结束，骨形 成总是偶联（coupling)于骨吸收，形成一个骨重建周期 (remode丨ing cycles)，即骨重建单位（bone remodeUng unit BRU)，也称基本多细胞单位（basic multiceUu丨ar unit BMIJ)。

骨重建是吸收旧骨形成新骨的过程，故#重建就是骨组织的更新（renewal)即骨的转换（bone turnover) 过程。

在骨重建过程，骨吸收量与骨形成童相等，骨量平衡 为零，这多见于生长期的骨骼，骨吸收量小于骨形成ft, 骨馕平衡为正，这种情况多见于举m运动员、甲状旁腺功 能低下以及用促骨形成药物治疗时。在骨重建过程，骨 吸收量大于骨形成量，骨董平衡为负，而出现骨的丢失 (bone loss),成年以后的骨重建多处于这种状态。这种状 态下的骨丢失，有随者年龄增加出现的骨丢失（生理性骨 丢失），有闭经雌激素缺乏等多种原因引起的骨丢失（病 理性骨丢失）。病理性骨丢失由于骨吸收激活加快，骨表 面#璽建单位增多，骨的转换率增高所致。

在组织水平，BPs对骨吸收的抑制主要是对骨重建 或件转换的抑制，表现在生化指标的下降，骨密度的增加 等方曲。

在生化指标（biochemical markers〉上，骨吸收指标 (bone resorptive markers)最先下降，2个月时达最低水 平。随后，背形成指标（bone formation markers)也下降， 但出现稍晚，一般6个月时达最低水平。这表明BPs类 的主要作用（primary effect)是抑制骨吸收，随者骨吸收的 抑制，与其相偶联的骨形成也受到抑制，骨转换减慢。

在骨组织学检查（histologica丨examination)及组织形 态计童测定（histomorp丨Kjmetric measurements )也呈现骨 转换的抑制。在动物和人体用有效刑M的BPs后，类骨 表面（Osteoid surface)、矿化表面（mineralizing surface)及 竹形成率（bone formation rate)降低50%以上，同时在组 织学卜.也证明BPs对骨形成没有直接抑制作用。

在骨尬上，BPs对绝经后或其他原因引起的骨质疏 松症有增加骨M作用，治疗后，#密度的增加一般可达 4%~8%〇

2.  双膦酸盐类在细胞水平的作用机制双膦酸盐 类（Bisphosphonates BPs)抑制骨吸收的作用机制在细胞 水平主要是作用于进行丹吸收的破骨细胞及有关细胞，

在给大鼠幼嵬（pups)皮下注射药理活性剂撤（一^ macologically active dose)的放射性标记（radiolabeled)阿仑 膦酸& ([butyl - 2，3 - ³H] alendronate)后 24 小时内， 50% -70%的骨吸收面（以破骨细胞出现为标记）檯盖一 层阿仑膦酸盐，而只有5%的骨形成面有一层标记物覆 盖。丨2小时后50%的小梁骨表面的破骨细胞内含有放

射标记的阿仑膦酸盐。在6天到7周时，放射活性的阿 仑膦酸盐被埋人新形成的骨绀织中^[121。

BPs这种组织特异性粑向#矿（tissue specific target­ing to bone mineral), 特别楚把向破骨细胞活化部位 ，并被 破骨细胞摄取（taken up)的实验说明，BPs抑制骨吸收是 通过对破骨细胞或其他细胞的爽接或间接作用所致。

3.   双膦酸盐类对破骨细胞的作用 BPs对破#细 胞的作用分直接作用和间接作用。这里讲的是BPs对破 骨细胞的冇接作用，BPs对破骨细胞的间接作用在BPs 对成骨细胞的作用中讲述。

BPs对破骨细胞的直接作用主要是抑制破骨细胞的 活性（activity )、活化（activating )或诱导破骨细胞调亡 (apoptosis)两个方面。

BPs直接抑制破骨细胞活性是从活体观察到破骨细 胞皱摺缘消失提出来的。

皱楮缘是附者在骨表面的破讶细胞浆膜（plasma membnme)翻转卷缩形成，它紧紧地附着于骨表，环绕形 成一个半空泡状密闭的微环境，以进行骨的降解（degra­dation) 、 内化 （ internalized) 及转输 （ transported) 。 因此 ，皱 播缘的形成是破针细胞进行骨吸收所必汲_u在用电微镜（electmmicroscopy)对经阿仑膦酸盐处理 的破骨细胞进行观察发现破骨细胞缺乏皱褶缘，虽然仍 安静地附于伢表，伹无活性。在实验室或在活体均发现 经BP处评的破背细胞一个S著的特征是缺乏皱褶缘。 同时，BPs也能劈裂破骨细胞的细胞骨架（cytoskdeton)和 引起肌动蛋白环（actin rings)的丧失。BP使破#细胞皱 褶缘丧失和抑制肌动蛋白环的形成就足以防止骨吸收。 间时也发现利塞膦酸盐在实验室或在活体均有增加破骨 细胞凋亡作用。

闕亡或程作件.细胞死亡（programmed cell death)是破 骨细胞正常死亡途径。促进凋亡就缩短破骨细胞的生命 期限，降低破骨细胞的骨吸收。

4.  双膦酸盐类对成骨细胞的作用实验发现，在 有成骨细胞存在下，一苎双膦酸盐在纳米克分子浓度 (< 10 ⁶M>下就能抑制破骨细胞前体（precursors)的葬集 (recruitment)分化（differentiation)或融合（fusion)。在大 鼠成骨细胞经低浓度有效BP短暂或持续处理后，其培养 基含有一种能降低#吸收的W子，这个因子分子m低 (<丨0 Kilodalton),lfif且作用于破#细胞前体.抑制破骨 细胞的形成及抑制破#细胞的活化。BPs通过对成骨细 胞的作用，间接地作用于破骨细胞，达到抑制骨吸收作 用。

破骨细胞可以存在一种以上的活化状态，在每一个 骨苽建周期的启动，需要成骨细胞对破骨细胞的启动或 活化，促进破骨细胞的形成（发生、募集）而破骨细胞也需 成背细胞的再活化信兮（reactivation signal)，使破骨细胞 具有活性（activity)。

BP通过成钟细胞抑制破骨细胞的活化就抑制了骨 重建周期的启动，抑制或降低了骨車建（或骨转换）率，使 骨单位再次发牛骨重建的机会减少而有更多的时间完成骨的矿化。随宥骨重建空间的减少，骨丢失减少，骨M增 加，这是BPs抑制骨吸收的一个重要机制。

1^5_?进入体内，需经骨矿摄取，即与骨矿结合，因为 未被骨矿摄取的将从体内淸除。

BPs与骨矿物质结合是在活化的骨吸收表面（包括 已活化而破骨细胞尚未到来的骨吸收表面）及骨形成表 面，而不M在非活化的骨衣面_s在正常骨组织的三千五 万个#单位中，任一时间内均有五百万个骨单位处于针 吸收或骨形成阶段，可供BP结合。实验发现，不能形成 皱褶缘（ruffled border)、不能进行骨吸收的oc/oc小鼠的 破骨细胞在同结合有BP的骨培养时就不受的影响， 同时降钙索（Caldtonin)在实验上也能防止结合在骨内的 BP对破骨细胞的抑制作用。由于不能进行#吸收或抑 制骨吸收，使BP不能从骨内游离出来，因而就没冇作用。

这些表明与骨矿物质结合的BP是没有活性的，只有 从#内释放出来才能发挥对骨细胞的作用。

BP从骨内释放出来，须经骨的酸化。f|•的酸化有经 背吸收时.破骨细胞泌酸对#矿物质进行酸化、溶解，即 吸收性酸化（resorptive acidification)游离出BP。这样游 离出来的BP浓度离，除经破骨细胞吞噬，对破背细胞产 生一系列抑制作用外，还可立即作用于破骨细胞，使破骨 细胞皱摺缘对离子的“渗漏性（leakiness)”增加，并引起皱 褀缘丧失，停止吸收。

骨的酸化也可经破骨细胞、成骨细胞或其他细胞排 酸，对#迸行酸化但不进行骨吸收，即非吸收性酸化 (nonresorptive acidification)，游离出 BP。正如在 pH 7. 5 时结合到羟磷灰石的BP在PH 3.5时就能释放50% — 样，是由于BP在PH低时，对Ca²⁺的整合（che丨ate)力低。 非吸收件酸化可使细胞和底物间pH低达4以下，这足以 使BP游离出来。非吸收件酸化游离出来的BP浓度低， 但足以作用于破骨细胞，抑制破骨细胞的活化（activa­tion), 足以作用于成骨细胞 ，抑制成骨细胞对破骨细胞发 出活化、再活化信号，这就是Owens等提出的BP抑制破 骨细胞活化的非吸收性机制（nonresorptive mecha- nism)【丨³】。

在细胞水平，BPs如结合于骨内的阿仑膦酸盐通过 骨吸收时释放直接作用于破骨细胞，怛浓度要高.通过非 吸收性酸化释放，经成骨细胞系间接地作用于破#细胞， 只黹比较低的浓度。貞接作用于破#细胞主要是抑制破 舒细胞的活性即吸收的能力和促进破骨细胞凋亡，缩短 其生命期限，降低饽的吸收，减少骨丢失，而间接作用则 是抑制破骨细胞形成和活化，降低竹虚建或甘转换率，喊 少骨重逹空间，增加骨甩,，

1.  双膦酸盐类在分子水平的作用机制双膦酸盐 类（Bisphosphonates BPs)在分子水平的作用机制主耍是 含氮双膦酸盐类抑制蛋白异戊烯化，非含澉双膦酸盐类 代谢成ATP类似物及其他。

[16]    含藏双膦酸盐类抑制蛋白异戊烯化（丨nhibitionof protein prenylation by nitrogen - containing bisphospho- nates)。含氣双鱗酸故类（nitrogen - containing bisphos-

[17]    phonatcs N- BPs)抑制蛋白异戊烯化是N- BPs抑制作 为蛋白异戊烯化底物的类异戊二烯脂的合成所致。

[18]    类异戊二嫌脂（isoprenoid lipids)的合成与胆固辟 (cho丨estcro丨)的合成呉有共同的通道，即甲羟戊酸盐通道 (mevalonate pathway),如图 19 - 7〇

[19]    类异戊二烯脂（丨soprenoid )主要是FPP和GGPP。 目前一致认为是FPP合成酶通过IPP与DMAPP及GPP —系列缩合（Successive Condensation)合成 FPP N - BPs 抑制的主要娃FPP合成酶，但对IPP异构酶、丨)MAPP合

[20]    成酶、GPP合成酶、GGPP合成酶以及鲨烯合酶等也有抑 制作用。

[21]    N- BPs对热換酸类异戊二稀胞（isoprenoid pyrophos­phate) 合成过程中酶的作用机制上 ，目前认为是 N~ 以 焦磷酸类异戊二烯脂碳阳离子转移状态类似物(cartecation transition state analogs)起作用¹¹⁴¹。下面以 DMAPP、GPP•典子 化(ionization)后形成的碳阳离子转移状态即碳阳离子中介物 (carbocation intermediates)与几种 N- BP 氣质子化形式(N^- protoned form)作一比较，如图 7 - 4。

[22]    CH, -CO-C〇A 乙酰辅酶 A(Acctyl C_〇A>

[23]    CH,

[24]    COOH-CH₂-C-CH₂-COC〇A 羟甲戊二酰辅LHydroxy-P-methy卜gluuryl-CoA HMG-CoA) OH

[25]    他汀类

[26]    (Slatina)

[27]    HMC-CoA    (HMG-CoA reductase)

[28]    CH,   丨PP 异构酶(IPP isomenwe)

[29]    CH, =C-CH,-CH₂0-P-P    ^     ► CH, -C=CH-CH₂ O-P-P

[30]    异戊烯焦磷酸盐  二甲丙烯焦磷酸盐

[31]    (Iaopentenyl pyrophosphate IPP)   (Dimethylallyi pyrophosphate DMAPP)

[32]    I   ,    |

[33]    j GPP 合成鵑(GPP 町ntheuwe)

[34]    含氣双膦酸盐类（N-BPa) —^卿合成

[35]   

[36]    藍嫌（SquaJene).

[37]    /

[38]    胆囲醇（Cho丨c你rol>

[39]    CH,   CH₃

[40]    CGPP 合成酶(GGPP BymheUw)

[41]    焦磷被找牛儿基找牛儿酿(Geranylgeranyl pyrophosphate GGPP)

[42]    图 19^_7 甲轻戊酸故通逍（Figl9-7 Mcvalonatepathvvay〉

H，C  CH, 0

、C=CH-CHr-CHr—dcH —CH₂-0 —I—〇-0

5.  |—〇■

H,C

GPP 离子化

CH,

0

II

；C=CH-CHj—CHj-C*—CHj-CHj—0—P—0*

0

十.

DMAPP

离子化

0

H₃cZ

；C* —CH₂-CH2—0—P—〇'

如图19-8,奥帕膦酸盐的氮质子化状态和异构陏 就以DMAPP碳阳离子转移状态类似物与IPP异构鵑结

抑制剂一样与DMAPP离子化形成的DMAPP碳阳离子 合而抑制DMAPP的产生◊同样，伊班膦酸盐等也以

转移状态十分类似。同样伊班膦酸盐氮质子化状态和合 GPP碳阳离子转移状态类似物与GPP合成酶结合而抑

氮类异戊二烯GPP类似物一样与GPP离子化形成的  制了 GPP的合成。

GPP碳阳离子转移状态也十分类似。这样，奥帕膦酸盐

DMAPP璇阳离子转移状态或中介物

GPP璇阳离子转移状态或中介物

H,C.

H—N. HjC^

CH₂-CH,—0-P—〇-

0

I

H,C、

I

H，C’

CH,

C=CH—CH₂-CH₂-I»

0

CH,-CH₂—0 — 1-0- 0

异构酶抑制剂

o

含氯的类异戊-烯GPP类似物

0

h₃c、   I

H—N♦—CH:—CH₂—C—OH H,C’ |

0

奥帕麟酸盆（氦质子化状态）

H,C

H,C，(

lj—CH2*~CH2—<

CH,

I

-N* — CH₂

I

H

0

crJ-

伊班貭酸盐（氟质子化状态）

图19-8 DMAPP和GPP碳阳离子转移状态的结构与含觝双W酸盐类奥帕膦酸盐和伊班》酸盐的钴 构比较_a

N- BPs的氣质子化形式与异戊烯脂（1PP、DMAPP)、 类异戊二烯脂（GPP、FPP、GGPP)的碳阳离子转移状态十 分类似，因为二者均各有两个膦酸盐组或磷酸盐组，而且 在大致相同空间方位(spatial orentation)上均各有一个阳离 f中心（cationic center),前者是氣阳离子，后者是碳•阳离

子。这种类似，使N-BP_S对甲羟戊酸盐通道的多种酶免 IPP异构酶、GPP合酶、FPP合成酶、GGPP合成酶以及S 烯合酶等都有抑制作用。但由于各种N-BP在结构上毛 所差异，作用的酶也不〜样。目前认为含氮双膦酸盐类注 要抑制的MFPP合成酶。由于对这些酶的抑制，致使作，

类异戊二烯脂(boprcnoidlipids)的FPP和GGPP合成障碍， 而类异戊二烯脂是小GTP酶（small GTPases)"^s]即小鸟苷 三软酸酿(small guanosine triphosphatases)或小 GTP 结合蛋 白（snrw丨丨（7TP binding proteins)转采后-兄戊铺化（prenyladon) 的底物(substrate)。

异戊稀化（Prenylation)是指脂肪链的转移（transfer of CH,   CH,    CH,

faffy add chains)，蛋白的异戊烯化这里指的是小GTP醸 的异戊烯化，即FPP或GGPP的脂质部分转移到小GTP 陶的半犹氣酸残端（cysteine residue)形成F化蛋白（farne- sylated protcine)或 GG 化蛋白(geranylgeranylated pro- teine)如图 19-9。

0 0

_H，c"念

FPP

F化蛋白

CH,

CH,

CH,

CH,

0

^s~~

小GTP酶

GGPP

GC化蛋白

^S~(^Rh〇^)

图 19 - 9 小 GTP 胸异戊缔化（Figl 9 - 9 prenybtion of sma丨丨（TTPases).^{s 1}

小GTP稱主费有二类，一类是与GG化（geranylge- rany丨ation)4{关，如Kho、Rac、Rab,这类蛋白与破骨细胞 膜的转运、细胞骨架和细胞凋亡有关，另一类是与F化 ({81^615>^丨011)有关，如1^35及匕301丨1113，这类蛋白也与破 骨细胞的结构和凋亡有关。

在N- BPS抑制破骨细胞付吸收分子机制上，主要 足抑制GGPP的合成，抑制小GTP麻的GG化，使GG化 蛋白丧失。

异戊稀化蛋白（preny丨ated proteins)主要是GG化蛋 白，是重要的信号運白（signaling proleins)。异戊稀化起 到使这些蛋白靠到细胞膜上（anchor in cell membranes)。 异戊烯化蛋白控制着破#细胞的细胞形态学（cell mor­phology )、细胞膜 的转输、细胞骨架 （ cytoskelctal) 的组合 (assembly〉、皱褶緣（ruffling border)的形成，细胞内的信

6.  amino acid + ATP(Appp)

氨基酸 三磷酸腺苷

号（intracellular signaling)乃致细胞凋亡（apoptosis)等多种 功能。

闪此抑制类异戊二烯脂质GGPP和FPP的合成和 蛋白的异戊烯化是N - BP_S抑制骨吸收的主要分子机 制。

2.  非含氮双膦酸盐类代谢成三磷酸腺苷类似物。 畀在丨981年就认为BPs在代谢上是具有悄性的（inert), 不能被代谢的。丨992年Rogers等^:5]就开始发现一些结 构比较简单与PPi十分类似的BP如依衿膦酸盐、克洛膦 酸盐等在细胞内能代谢成含甲基的三磷酸.腺苷（ATP)的 类似物（AppCp型这个代谢过程娃经2型轵酰转移核 糖核酸合成酶（type 2 class of aniinoacy〗 tRNA synthetase) 成员以逆向反应所催化其反应式如下：

amino acid ~ AMP + PPi 氨酰腺苷酸  焦磷酸盐

[43]    amino acyl - tRNA + AMP(Ap) amino acid - AMP + tRNA

衩酰转移核糖核酸 腺苷酸 <   氨酜腺苷酸 转移核糖核酸

7.  amino acid + AppCp    amino acid - AMP +

氨基酸 含双膦酸盐_氨酰腺苷酸

的ATP类似

物（通式）

8.  amino acid + ApCCI₂ p amino acid - AMP

贫基酸 含克洛膦酸盐"一氨酰腺苷酸

的ATP类似物1式是可逆的。3式、4式在氨酰转移核糖核酸合成 酶逆向催化下，双膦酸盐和克洛膦酸盐可取代焦磷酸盐 (1式）或和转移核糖核酸（2式）竞争与袄酰腺苷酸反应 生成含双膦酸盐的ATP类似物(3式）和含克洛膦酸盐的 ATP类似物(4式）。

ATP类似物与ATP不同之处在于前者含有P_C_

P键，后者仅含P—O— P健，因此ATP类似物就不能被 水解、被破坏，这些具有细胞毐性作用（cytotoxic effect)的 代谢产物瘩积于细胞内，抑制了细胞内依赖ATP的酶系 统功能，干挠细胞的代谢和种种功能，并导致细胞拥亡。 这是目前公认的NN-BPs抑制骨吸收的主要分子机制。

在引起细胞调亡上，NN-BPs是由于ATP类似物在 细胞内蓄积并进人线粒体，抑制腺嘌呤核苷酸移位酶 (adenine nucleotide trans丨ocase，ANT)，开放通透性转换孔 (Permeability transition pore，PTpore)，使调亡前因 T (proapoptotic factors)包括细胞色素 C( Cytochrome C)从 线粒体向胞液（Cytosol)释放，从而活化胱天蛋白酶 (Cysteinyl aspartate specific proteinase Caspase)，主要始 Caspase-3,引起细胞调亡^[161。同样，N-BPs也是由于 异戊烯化障碍的小GTP酶（小GTP结合蛋白），在细胞 内蓄积,包括细胞色索C的调亡前因子向线粒体周围间 隙释放，激活Caspase-3有关

由于BPs对破针细胞骨吸收作用的主要分子机制不 同，一般认为BPs可以分为两大类即含氮的双膦酸盐类 (N-BPs)和非含氮的双膦酸盐类（NN-BPs)。NN- BPs R前应用的只冇依替膦酸盐、克洛磷酸盐和替鲁膦 酸盐，而且是抑制骨吸效力最低的3个双膦酸盐。N— BPs是R前广泛应用并不断开发的…大类抗骨吸收效力 最强的双膦酸盐类。

在作用机制的分子水平上，除上述两大类BPs具有 不同的主要作用机制外，他们共同对某些酶还有直接抑 制作用。

BPs的依替膦酸盐、替鲁膦酸盐、阿仑膦酸盐、英卡 膦酸盐能冉接抑制位于破骨细胞皱褶缘的空泡型质子泵 ATP酶，其抑制效力与焦磷酸盐（PPi)或磷酸盐 (phosphate)相似或稍差，后者抑制的浓度约为 5x l〇 ³M，替鲁膦酸盐作用更强，其丨约为5X丨〇_⁷ M,这个浓度与其在破骨细胞内能达到的浓度相似。

BPs对破骨细胞质子泵ATP酶的抑制就抑制了破 骨细胞质子的排出，抑制了对骨矿物质酸化和分解。

在实验上，BPs对某些水解除（hydrolitic enzyme)如 请酸牌（phosphatases )、酸性辑酸水解酶（acid phosphohydrolascs)有直接抑制作用，并能阻止溶酶体酶

pCp

双膦酸盐

(通式〉

+ pCC12p 克洛膦酸盐

(Lysosomal enzymes〉的释放，这就抑制了对骨基质蛋白 的水解性降解。

BPs通过七述抑制破骨细胞对骨无机质和有机质分 解作用而抑制了破骨细胞的骨吸收作用。

在实验h ,BPs对蛋白酿氣酸辑酸酶（protein tyrosine phosphatases PTPase)有直接抑制作用。

PTPase是蛋白胳氨酸辑酸化（phosphorylation)的酶， 蛋白酩氨酸的磷酸化对控制细胞生长、分化和活性的信 号传递通道（signa丨transduction pathway)是至关重要的〇

PTPasee存在于破骨细胞内，PTPasc 〇在破骨细胞 和成骨细胞内均有。

在实验上，阿仑膦酸盐仅3pM的丨Qo剂里和依替膦 酸盐仅的丨剂童就能抑制破骨细胞的FTPase。 阿仑膦酸盐在0.5_MM的丨〔、和依替膦酸盐在0.2/iM的 ICw对在破骨细胞和成骨细胞的PTPase a就有抑制作 用。但是BPs在实验上抑制PTPase的效力与其在活体 抑制骨吸收的效力之间缺乏相关性，这说明BPs对 PTPase的抑制不是其抑制骨吸收的主要机制。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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