成都华西华科研究所分析中药治疗骨质疏松分子机制与QCT骨密度软件体模检测

蛣激素受体和骨保护素

骨质疏松主要发牛在骨小梁、成骨细胞、破骨细胞及 骨《箪质细胞构成的骨组织微环境中，由各种激索、细胞 因子交织而成的复杂网络对骨代谢起重要渊铃作用。研 究发现骨组织中成骨细胞、骨髄基质成骨细胞前体和破 骨细胞均存在有ER。雌激素通过作用于ER而发挥对 种代谢的调节作用PMO的主要细胞学因素系由 于骨组织中破骨细胞形成活跃所致，自Simonet丨997年 t先分离出OPG以来，大墩研究已证实，作为各种激 素和细胞因子调节破#细胞形成的终末因素，OPG在骨 纽织微环埦中，是成骨细胞和#髄基质细胞调柠破骨细 胞分化、活化的重要分子机制¹雌激索坷剌激成骨 细胞分泌OPG,阻断破骨细胞骨吸收信号的传递.从而 拮抗去卵巢大鼠介导的伢质疏松杨召等通过检测去卵巢大鼠给予补肾中药后腰 椎内ER mKNA及OPG mRNA的表达，进一步探i、t补袢 中约防治骨质疏松的分子机制。将雌性3月龄S丨）大鼠 48只，随机分为卵巢切除+补肾中药防治（H丨)P),卵巢 切除+雌激索（倍美力）防治（ER),骨质疏松（卵巣切 除）（OVX)及it常对照绀（SHAM) 4组，每绀丨2只。术 后12周处死大鼠，取L3椎体，异硫氰酸胍一步法提取总 RNA,嵌套式反转录聚合酶链反应（NRT-PCR)，扩增待 检测各组EK mRNA及OPG mRNA的表达。间时取L4 椎体，行骨组织形态计童学检测。结果显示HDP组ER mRNA及OPG mRNA阳性表达率分另为75. 0%和

66.7%_;即组1^阳1^从及0?0〇1|^六阳性表达率均为 83. 3% ; OVX组各例ER mKNA均无表达，2例OPG mRNA呈弱阳性表达（阳性率为丨6.7%);SHAM组呈ER mRNA及OPG mRNA阳性表达。乂2检验，HDP组与ER组 比较EK mRNA及OPG mRNA阳性表达率均无显著性差 异（/³>0.05);该两组与(^乂组比较，已只〇11^八及0?(3 mKNA阳性表达率均有高度显著性差异（P<0.01h而与 SHAM组比较，HDP组ER mRNA，EK组KK mKNA及OPG mKNA阳性表达串X显著性差异（P>0.05)，但HDP组 OPG mRNA阳性表达率有显著性差异（0.01<P<1.  05)。骨绀织形态计St学检测，OVX组#体积、#小梁厍 度及骨小梁数目均比SHAM组敁著减少，而骨小梁间隔 显著增大。同EP组相似，HDP组骨体积、骨小梁厗度显 著增加，虽也使骨小梁间隔稍有减少，但与OVX组比较 无统计学差异。表明补肾中药通过直接作用于骨组织中 ER,增强ER mRNA的在达，并刺激OPG的分泌，从而冇 塑替代雌瀲家，对去卵巢大鼠的背质疏松有明M的防治 作用。

(二）  一氧化氰和一氧化氮合酶

箫劲夫等研究健骨二仙九对骨骼局部调节、效应分 子影响^m。通过原位杂交在转录水平研究健骨二仙九对 I嘲胶原基因和诱生型一氧化氮合成酶（iNOS)基因表 达的影响。通过免疫组化在翮译水平研究健钟二仙丸对 内皮细胞〜氧化氮合成酶（eNOS)基因和iNOS基因表 达的影响。发现健骨二仙丸珥强烈促进骨骼局部I沏胶 原的表达，阳性细胞数明显多于对照各组，且有更多成骨 细胞向骨细胞形态转变，其对1型胶原基因表达促进作 用强于Premarin。健骨二仙九还M著促进骨胳局部eNOS 基因的表达，显著抑制骨骼咼部iNOS基因的表达，其效 果强于Premarin等雌激索，而且健骨二仙九的以上作用 都与剂M正相关。通过加入氨基肌(AG)造成一氧化氮 合成酶（NOS)表达过度抑制的低NO浓度细胞模型；通 过TNF -_a、】L - 10、丨FN-y等多种细胞因子造成高 NO浓度的细胞模咽。加入健骨二仙丸提取物后发现，捉 取物对NOS表达过度抑制的低NO浓度有较好的恢复作 用，而对尚表达缳的NOS及其合成的NO作用不明显。 通过免疫组化对Be丨-2基因、Bax基因的表达进行研 究，发现健骨二仙丸提取物可促进HOSTE- 85细胞 Bcl-2基因的表达而抑制Bax苺因的表达。从而促进成 骨细胞的功能活动。在体动物实验发现，健骨二仙丸可 抑制OVX大鼠升高的iNOS表达，从而减轻功能亢进的破 骨细胞性骨吸收，而对骨组织正常生理活动中的eNOS合 成有适度促进作用。离体成背细胞培养研究，进一步发 现健骨二仙丸可从苺因转录和表达水平影响NOS的合成 与分布，对离水平的NOS影响较少，对低水平的NOS却 有良好的恢复作用。而NO、NOS位号系统在OP发生中 的重要生理病理学意义已是公认的亊实^{[18 ]}。

(三）  1型胶原和基质金属蛋白嗨-9

新近发现在破骨细胞M高表达的基质金厲蛋白酶9(Matrix Meta丨loporoteinase - 9, MMP — 9)可降解 I、（〇、IV、V型胶原，是破骨细胞骨吸收的关键酶之一¹¹⁹^。 MMP-9亦称为92-kuIV型胶脉酶和明胶酶B,巳发现 它在破骨样细胞中呈卨表达，旦在破骨细胞性钟吸收中 发挥重要作用^U2^。Grigoriadis等^:25]利用分子生物技术 培育出c-fos基因敲除小鼠.该鼠在破骨细胞#吸收活性 低下同时，骨组织中MMP -9表达亦较正常小鼠下降，其 在成熟多核破骨细胞未见表达。提示MMP 9表达水平 口J随背吸收活性的不同而改变。杜靖远等运用补肾中药 密骨片对骨质疏松进行治疗以后，发现密骨片在抑制# 吸收活性同时，破骨细胞该酶的表达显著下降¹²⁶¹。沈霖 等发现补肾剂防治骨质疏松的机理与降低破骨细胞 MMP-9表达有关^[~。至于密骨片引起MMP-9表达 改变的确切机制有待进一步探讨。实验中还发现，骨基 质表面一些衬细胞中亦可见MMP-9,推测这部分酶的 作用与去除骨表面的类骨质层，有利于破骨细胞与矿化 基质接鼪、粘附有关。

骨形成主要是I型胶顷的合成和钙化„ T_uren等报 道骨绀织I型胶厣mRNA水平与大鼠背形成活性密切相 关^[2^。国内学者已经证明，密骨片可使体外埼养成骨细 胞增殖。mRNA水平与大鼠骨形成活性密切相关。研究 发现，骨质疏松模鼠骨组织I型胶原表达升咼，用补肾中 药治疗后，其表达反而下降，与密#片对体外成骨细胞培 养的作用不同。杳阅文献，骨质疏松在骨吸收增加同时， 骨形成活性亦相应增加，骨代谢呈高转换状态。Sims等 发现这是由于破骨细胞活性增强时，骨基制降解增加，从 其中释放的骨形成促进因子如转化生长因子（TGF),骨 形态发生蛋白（BMP)和胰岛素样生长因子（IGF)等增 多，可剌激成肯细胞，导致骨形成一定程度增强^:29)。

(四）细胞因子

2.  白介-6UL-6)丨L-6在骨质疏松中的作用主 要表现为对破骨细胞及其前体（如粒-巨系枏细胞 CFU-GM)的影响，它不仅能影响其产生数M,尚可影响 其功能^t301。当骨髄微环境受到雌激素缺乏等倍号的剌 激时，丨L-6与其他骨吸收因子及受体协同，具有促进骨 吸收的作用。沈霖等研究表明，#质疏松患者的血清IL -6水平普遍高于正常值，而采用中药密骨片治疗后其 值明显下降，提示中药密骨片可能通过调节全身的激素 分泌，抑制IL 6的产生，增加IL-6抗体的数H而抑制 骨吸收。进一步研究发现，通过斑点杂交技术及原位 杂交技术进行进行研究发现模甩组大鼠IL-6 mRNA表 达较假手术组明M升A,而密骨片治疗组治疗后IL-6 mRNA表达明M下降。提示补肾法抗骨质疏松的作用机 制与补背中药抑制丨L-6的产生有关。

3.  肿瘤坏死因子-a TNF-a刺激成#细胞分泌粒

细胞-巨噬细胞集落剌澉因子（GM- CSF)、白细胞介 索-6(比-6)等因子，诱使始祖细胞变为破骨细胞。同 时，可以刺激NO的产生，而高浓度NO对成骨细胞系的 增殖有抑制作用。Adrian等研究发现，成钟细胞可以产 生TNF-a,丨L-6和丨L-   E2的存在可以抑制这些细胞因子的产生。E2减少时抑制作用下降，使骨中

IL-1和TNF产生增加，进一步剌激成骨细胞产生IL- 6,三者共同作用于破背细胞，使骨吸收增强。随着年龄 的增高，骨骼系统、内分泌系统的功能退化，雌雄激素减 少，致使末梢血单核细胞丨L-6、TNF等细胞因子产生过 里，经雌激素和降钙索治疗后可得到恢复。林燕萍等研 究发现.骨质疏松患者TNF水平较正常值高，而中药治疗 可显著降低TNF水平，提示补肾中药可能通过增加雌激 素和降钙素的分泌而降低TNF的水平。

4.  转化生长因子-P转化生长因子-p(TGF-p) 足一种具有双向调节作用的生长因子。主要表现促进成 骨细胞增殖和分化，但在浓度改变时也可以表现出对成 骨细胞的抑制作用。它还可以通过剌激或抑制其他细胞 因子的产生或调控其作用来控制骨的修复和审建。被认 为是成骨细胞与破骨细胞之间相藕联的因子。Ibbotson 等的实验表明.去卵巢的实验大鼠，当E2水平下降时，血 淸中TNF-a含S升高的同时，TGF-01的浓度却明显 降低，提示TGF〜pi的分泌可能需要雌激索等相关因素 的刺激^:M1。研究发现喂服健骨颚粒后，血淸E2水平 和TGF-pi的浓度都明S回升，TNF-a含S却明M低 于模型组，与同期生理盐水组相比，均有敁著统il学意 义。健骨親粒可能通过调整内分泌功能或通过植物类激 素样作用使骨质疏松模型鼠体内E2水平升髙，从而制约 了 TNF-a的合成和分泌，血淸中TNF-_〇的浓度降低， 使得TNF-a对TGF-pi的拮抗作用也降低，导致血淸 中TGF-pi的浓度相对升高，成骨作用增强，破#活动 减弱，纠正了骨代谢的负平衡态，使骨g增加。

5.  Fas在骨重建的代谢转换过程中，旧骨被吸收的 进展速度和持续时间取决于破骨细胞的不断补充。现已 证实破骨细胞的消失是细胞凋亡的结果^l3u⁶¹ ,破骨细胞 凋亡发生过多过早。则丨H對被吸收的范围减少；反之，则 吸收的范围增大。破骨细胞凋亡受体Fas存在细胞表 面，在与“死亡配体"（FasUgamKFasL)结合后的几秒中 内转导细胞凋亡信号，并于几小时内发生细胞凋亡^[371。 研究表明^[381,用补肾中药（杜仲、补骨脂、淫羊隹等）灌服 的去卵巢大鼠，其破骨细胞内Fas蛋白的阳性颗粒的实 面积、平均光度、阳性单位值较牛理盐水灌服组明M增高 (P<0.05);而与雌激索组、假手术组比较则无敁著性差 异（P>0.05)。提示补衧中药能增强Fas在去卵巢大鼠 破骨细胞内的衣达。由此推测，中药补肾法可通过调控 Fas蛋白来诱导破骨细胞判亡，从而达到降低破#细胞骨 吸收活动的作用。成都华西华科研究所分析研发定量CT QCT骨密度体模软件分析系统  
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